腫瘤低氧微環(huán)境是實體瘤最為顯著的特征之一。低氧狀態(tài)與許多腫瘤特性（hallmark）息息相關(guān)，包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成、代謝重編程、浸潤轉(zhuǎn)移，和放化療抵抗等。低氧驅(qū)動細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控、蛋白質(zhì)翻譯/翻譯后修飾調(diào)節(jié)等，其中由低氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-inducible factors, HIFs）所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是細(xì)胞低氧感知和適應(yīng)機(jī)制中最重要的調(diào)控方式。研究發(fā)現(xiàn)低氧刺激下細(xì)胞中有大量mRNA水平發(fā)生了改變，而這一現(xiàn)象卻無法用已知的分子機(jī)理（例如HIFs介導(dǎo)的相關(guān)通路等）進(jìn)行解釋。因此，細(xì)胞在低氧脅迫下的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制以及低氧驅(qū)動腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面仍存在許多未解問題，包括低氧與mRNA穩(wěn)態(tài)平衡之間的關(guān)系等等均有待于深入研究，這對未來腫瘤靶向治療和控制低氧相關(guān)疾病有著重要意義。
2021年9月13日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院余健秀/程金科/陳國強(qiáng)團(tuán)隊在Nature Communications雜志上在線發(fā)表了題為Hypoxia regulates overall mRNA homeostasis by inducing Met1-linked linear ubiquitination of AGO2 in cancer cells的最新研究成果。在此項工作中，作者首次發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)的AGO2蛋白M1型線性泛素化修飾能夠調(diào)控整體mRNA穩(wěn)態(tài)平衡，從新的角度揭示了腫瘤細(xì)胞低氧適應(yīng)的分子機(jī)理。
miRNA是一類廣泛存在于真核生物中，長度約19~25 nt、序列保守的非編碼單鏈小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平介導(dǎo)靶標(biāo)mRNA降解或翻譯抑制。據(jù)保守估計，miRNA可直接調(diào)控超過50%的蛋白編碼基因，參與近乎所有已知的細(xì)胞生命活動，形成了巨大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，深入研究miRNA介導(dǎo)的基因沉默及其調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義。雖然不同的miRNA獨立表達(dá)，有各自的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制，但是轉(zhuǎn)錄生成后所有前體miRNA都需經(jīng)過一條共同的加工裝配途徑才能夠發(fā)揮功能，該途徑異常將最大程度上破壞miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。余健秀團(tuán)隊長期研究工作發(fā)現(xiàn)該途徑中核心蛋白的翻譯后修飾對miRNAs通路起著重要調(diào)節(jié)作用Nature communications（2021；2015）、Molecular cancer（2017）和Nucleic acid research（2015；2018；2021）。AGO2蛋白作為miRNA通路的核心效應(yīng)分子，不僅對miRNAs功能的發(fā)揮起著決定性作用，對維持整個miRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性至關(guān)重要。因此，AGO2蛋白功能調(diào)節(jié)機(jī)制尤為重要，如AGO2乙酰化修飾（Oncogene 2019) 和AGO2磷酸化修飾 (Neoplasia 2020)等。
在此項工作中，作者首先通過RIP-seq/RNA-seq/miRNA-seq檢測發(fā)現(xiàn)：低氧條件下，miRNA通路抑制，其靶標(biāo)mRNA降解阻滯，進(jìn)而呈現(xiàn)整體性累積。采用定量質(zhì)譜分析表明：低氧能夠促進(jìn)miRNA通路核心效應(yīng)分子AGO2蛋白與線性泛素化鏈組裝復(fù)合物（linear ubiquitin chain assembly complex, LUBAC）相互作用。LUBAC是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個介導(dǎo)線性泛素鏈合成的E3泛素連接酶。體內(nèi)和體外的生化實驗均證實LUBAC能夠催化AGO2蛋白發(fā)生Met1型連接的線性泛素化修飾（Met1-linked linear polybiquitination，M1-Ubi），且該修飾具有動態(tài)可調(diào)控性，低氧信號對其具有誘導(dǎo)作用。結(jié)合高通量測序結(jié)果并進(jìn)一步實驗證實：低氧誘導(dǎo)的AGO2蛋白M1-linear-ub修飾能夠阻礙AGO2/miRNAs與靶標(biāo)mRNA結(jié)合，抑制了miRNA介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)，導(dǎo)致靶標(biāo)mRNA降解阻滯進(jìn)而整體性累積。最后，通過美國癌癥基因圖譜計劃（The Cancer Genome Atlas , TCGA）數(shù)據(jù)庫中大樣本肺癌測序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：在腫瘤組織中隨著低氧程度升高，miRNA靶標(biāo)mRNA水平整體性升高，兩者之間存在顯著的正相關(guān)性。提示在低氧環(huán)境下，miRNAs介導(dǎo)的基因沉默途徑抑制，導(dǎo)致靶標(biāo)mRNA整體性累積，由于大量靶基因水平失調(diào)，穩(wěn)態(tài)破壞，最終可能引發(fā)細(xì)胞惡變、腫瘤發(fā)生等。這一發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)觀點認(rèn)為低氧主要調(diào)控miRNA表達(dá)或加工生成，提出了低氧調(diào)控miRNAs活性的新機(jī)制。
綜上，該研究首次提出腫瘤低氧微環(huán)境調(diào)控mRNA穩(wěn)態(tài)平衡的觀點，并從新的角度揭示了低氧對miRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制，為腫瘤研究提供了新思路。此外，到目前為止，關(guān)于線性泛素化修飾的研究報道主要是在NF-kB等炎癥和免疫相關(guān)信號通路中。該研究鑒定了AGO2蛋白為線性泛素化新底物，首次證實M1-linear-ub修飾也可發(fā)生于miRNA途徑中，預(yù)示著其具有更廣泛的生物學(xué)意義，也將進(jìn)一步拓展M1-linear-ub修飾的研究到新領(lǐng)域。
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞分子生物系張海龍博士后、趙嫻副研究員和郭巖珉博士后為論文共同第一作者，余健秀研究員、程金科教授和陳國強(qiáng)院士為該論文共同通訊作者。該研究工作獲得了國家自然科學(xué)基金重點項目、國家自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究群體項目、科技部國家重點研發(fā)計劃項目、上海市自然科學(xué)基金原創(chuàng)探索項目等資助。
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