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長(zhǎng)期以來，人類白細(xì)胞抗原（HLA）全相合供者來源的匱乏始終是同種異體造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT）領(lǐng)域面臨的全球性挑戰(zhàn)。北京大學(xué)人民醫(yī)院黃曉軍教授團(tuán)隊(duì)首創(chuàng)的非體外去T細(xì)胞單倍型相合造血干細(xì)胞移植體系，極大的拓展了allo-HSCT的供者選擇范圍，理論上實(shí)現(xiàn)了"人人都有供者"的目標(biāo)——患者的直系或旁系血親均可作為潛在供者。然而，在該移植體系下，供者的選擇策略與受者的預(yù)后密切相關(guān)，直接影響急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host disease, aGVHD）、植入不良、感染及疾病復(fù)發(fā)等并發(fā)癥的發(fā)生率。目前臨床實(shí)踐中廣泛采用的供者選擇標(biāo)準(zhǔn)，包括"年輕、男性、非母系遺傳抗原不合"等原則，主要基于觀察性研究數(shù)據(jù)，其潛在的免疫學(xué)機(jī)制尚未得到充分闡明。此外，作為主流的單倍型移植方案，G-CSF動(dòng)員的供者外周血移植物中T細(xì)胞亞群的組成特征、功能表型及其與患者預(yù)后的相關(guān)性仍不完全明確。因此，“人人都有供者，誰是最合適的供者？”成為當(dāng)前allo-HSCT臨床亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。

研究團(tuán)隊(duì)首先通過臨床隊(duì)列研究，發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）動(dòng)員的供者外周血中，PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞的擴(kuò)增與移植受者aGVHD發(fā)生率呈顯著負(fù)相關(guān)（圖1）。進(jìn)一步分析表明，年輕男性供者外周血中PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞的水平在G-CSF動(dòng)員后呈現(xiàn)出更為明顯的擴(kuò)增。這一發(fā)現(xiàn)不僅為解釋當(dāng)前臨床實(shí)踐中年輕男性供者移植成功率較高的現(xiàn)象提供了免疫學(xué)的機(jī)制，同時(shí)優(yōu)化了供者選擇策略，提出了細(xì)胞免疫學(xué)的篩選標(biāo)準(zhǔn)而非僅以年齡和性別為主要考慮的原則。

圖1. G-CSF動(dòng)員后供者外周血中PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞比例增加且與受者aGVHD發(fā)生率呈顯著負(fù)相關(guān)

進(jìn)一步，單細(xì)胞RNA測(cè)序（single-cell RNA sequencing）結(jié)果確認(rèn)了PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞不僅具有TSCM特征，還表達(dá)較高的Treg特征基因和Teff特征基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)G-CSF動(dòng)員后該亞群中轉(zhuǎn)錄因子BCL6表達(dá)顯著增加。研究人員通過流式分析及體外共培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上確認(rèn)了供者來源的PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞具有雙向免疫調(diào)節(jié)功能，抑制T細(xì)胞增殖的同時(shí)殺傷Raji人淋巴瘤細(xì)胞（圖2）。

圖2. PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞兼具T_SCM、Treg和Teff轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征和雙向調(diào)節(jié)功能且高表達(dá)BCL6

為深入闡明該調(diào)節(jié)性亞群的功能及機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了aGVHD與移植物抗白血病（graft-versus-leukemia, GVL）效應(yīng)的小鼠模型。在C57BL/6J→BALB/c移植體系中，G-CSF處理顯著誘導(dǎo)供鼠脾臟中PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞的擴(kuò)增。過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)表明，該細(xì)胞群不僅能顯著改善受鼠aGVHD的臨床嚴(yán)重程度，同時(shí)保留了GVL效應(yīng)，使異基因受鼠的中位生存期顯著延長(zhǎng)（圖3）。值得注意的是，這一現(xiàn)象在不同物種間的重現(xiàn)性提示PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能在進(jìn)化過程中高度保守，且其可被G-CSF這一進(jìn)化中早期出現(xiàn)的細(xì)胞因子有效誘導(dǎo)，從而可在同種異體造血干細(xì)胞移植中發(fā)揮雙向免疫調(diào)節(jié)作用。

圖3. 供鼠來源的PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞緩解受鼠aGVHD并發(fā)揮GVL效應(yīng)

隨后臨床研究發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)allo-HSCT受者外周血及骨髓樣本的長(zhǎng)期隨訪，供者來源的PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞不僅能夠成功歸巢至受者骨髓，而且可在其中長(zhǎng)期駐留（圖4）。這一現(xiàn)象提示該細(xì)胞可能在移植后抗感染免疫應(yīng)答及免疫重建過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。未來，深入闡明PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞的歸巢機(jī)制、長(zhǎng)期存活特性及其與異基因造血干細(xì)胞植入、骨髓微環(huán)境互作和免疫重建中的作用機(jī)制，對(duì)于優(yōu)化移植策略、促進(jìn)免疫重建以及揭示造血-免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要意義。

圖4. PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞歸巢并在臨床異基因移植受者外周血和骨髓中長(zhǎng)期存活

為探索PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞的分化調(diào)控機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)采用單細(xì)胞RNA測(cè)序、臨床隊(duì)列研究、Bcl6基因敲除小鼠模型、CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)以及核酸酶靶向切割與釋放（CUT & RUN）等實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)BCL6在此類調(diào)節(jié)性細(xì)胞的分化擴(kuò)增中發(fā)揮重要作用，闡明了BCL6是調(diào)控PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞譜系分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（圖5）。

圖5. BCL6是驅(qū)動(dòng)PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞譜系分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子

綜上所述，通過臨床隊(duì)列研究、免疫表型分型、單細(xì)胞基因組學(xué)和動(dòng)物模型等確定了一個(gè)新的TSCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞亞群，首次從供者角度系統(tǒng)闡明了G-CSF通過誘導(dǎo)PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞擴(kuò)增從而緩解allo-HSCT受者aGVHD發(fā)生的新機(jī)制（圖6），為優(yōu)化臨床供者選擇策略提供了重要的免疫學(xué)理論依據(jù)。研究首次鑒定了BCL6是驅(qū)動(dòng)該調(diào)節(jié)性細(xì)胞譜系分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)揭示了該細(xì)胞具有獨(dú)特的雙向免疫調(diào)節(jié)功能，在改善異基因移植患者遠(yuǎn)期預(yù)后方面極具臨床應(yīng)用價(jià)值。值得關(guān)注的是，與近期美國FDA批準(zhǔn)用于aGVHD治療的同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞不僅可作為供者優(yōu)選的潛在生物標(biāo)志物，為個(gè)體化供者篩選提供科學(xué)依據(jù)；同時(shí)基于其獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)特性，本研究結(jié)果將為開發(fā)防治aGVHD的創(chuàng)新T細(xì)胞療法提供全新思路。未來研究將著重于探索PD-1⁺CD8⁺T_SCM樣調(diào)節(jié)性細(xì)胞在臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用價(jià)值，并優(yōu)化供者選擇算法以進(jìn)一步提高異基因移植成功率。以上研究方向的推進(jìn)有望為allo-HSCT領(lǐng)域帶來創(chuàng)新性細(xì)胞療法，最終惠及更多臨床患者。

圖6. 全文研究機(jī)制模式圖

北京大學(xué)人民醫(yī)院劉丹博士和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所博士研究生王雪為本文的共同第一作者，北京大學(xué)人民醫(yī)院黃曉軍院士、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院胡炯主任、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所路麗明教授為本文的共同通訊作者。該研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)、國家自然科學(xué)基金等的資助。