體細(xì)胞突變是腫瘤,、衰老和其他多種疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因,，建立高效準(zhǔn)確的突變檢測(cè)技術(shù)是實(shí)現(xiàn)健康風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)及預(yù)警的重要途徑,。但是,，早期突變由于基因組上發(fā)生頻率極低和細(xì)胞散在發(fā)生，難以被測(cè)序錯(cuò)誤率很高的普通二代測(cè)序技術(shù)（NGS）檢測(cè)到,。公共衛(wèi)生學(xué)院欒洋研究員課題組自主創(chuàng)新建立的超低頻突變檢測(cè)技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)任意物種體細(xì)胞上全基因組范圍的突變檢測(cè),，最新成果于2023年10月在Nucleic Acids Research上以題為Genome-wide direct quantification of in vivo mutagenesis using high-accuracy paired-end and complementary consensus sequencing的研究論文發(fā)表。此外,，以基因突變?yōu)闄z測(cè)終點(diǎn)的人群早期效應(yīng)標(biāo)志也是致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要工具,。課題組應(yīng)用人群外周血建立了PIG-A基因突變檢測(cè)技術(shù)，已在致癌物職業(yè)暴露人群初步驗(yàn)證,，近期應(yīng)用于苯和多環(huán)芳烴風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,，研究成果于同年5月和6月分別發(fā)表在Environmental Pollution和Food and Chemical Toxicology期刊。上述技術(shù)為突變研究提供了重要工具。
基于NGS的低頻突變檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展
NGS的出現(xiàn)為突變檢測(cè)技術(shù)的革新帶來(lái)契機(jī),，但是,，目前普遍使用的NGS測(cè)序錯(cuò)誤率很高（~千分之幾），所以多應(yīng)用于檢測(cè)體細(xì)胞上發(fā)生的胚系突變,、和以克隆增生為特征的腫瘤細(xì)胞或單細(xì)胞上的突變分析,。而正常體細(xì)胞因環(huán)境等因素作用后全基因組上發(fā)生的微量突變負(fù)荷增加，則難以通過(guò)普通NGS檢測(cè),。
為了降低測(cè)序錯(cuò)誤率，目前公認(rèn)有效的策略是基于“分子一致性測(cè)序”的ecNGS（Error-corrected NGS）技術(shù),，簡(jiǎn)言之就是針對(duì)同一模板來(lái)源的多個(gè)拷貝測(cè)序后進(jìn)行錯(cuò)誤校正,，以提高準(zhǔn)確性。該策略最早由華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究者提出,，命名為“Duplex Sequencing”,，大大降低了測(cè)序錯(cuò)誤率。但是因?yàn)樵摷夹g(shù)引入PCR擴(kuò)增環(huán)節(jié),，目的片段產(chǎn)生的拷貝數(shù)過(guò)多,，因此測(cè)序效率很低，迄今為止僅應(yīng)用于局部的靶向測(cè)序及小型基因組,；Sanger研究所基于該策略也開(kāi)發(fā)了系列方法,，經(jīng)多次改進(jìn)后，于2021年在Nature雜志上報(bào)道的“NanoSeq”技術(shù),，準(zhǔn)確性不僅達(dá)到基因組自發(fā)突變水平,，還大大提高了測(cè)序效率，并應(yīng)用該技術(shù)探索了人體組織上細(xì)胞分裂程度與突變的關(guān)聯(lián),。該技術(shù)代表了本領(lǐng)域當(dāng)前國(guó)際最高水準(zhǔn),。
原創(chuàng)性低頻突變測(cè)序技術(shù)PECC-Seq
盡管已有上述ecNGS技術(shù)的見(jiàn)刊論文，但仍存在一些數(shù)據(jù)分析和技術(shù)上的壁壘使其無(wú)法被具體和廣泛應(yīng)用,。公共衛(wèi)生學(xué)院欒洋課題組經(jīng)過(guò)多年研究,，主導(dǎo)開(kāi)發(fā)了自主創(chuàng)新的分子一致性測(cè)序方法，命名為“PECC-Seq”,。技術(shù)原創(chuàng)點(diǎn)包括截短片段,，PCR-free文庫(kù)制備，DNA互補(bǔ)雙鏈通過(guò)雙端測(cè)序產(chǎn)生4條重疊片段,，與參考基因組比對(duì)進(jìn)行錯(cuò)誤校正,。該策略大大提高了NGS測(cè)序的準(zhǔn)確性和測(cè)序效率，首篇論文于2020年在領(lǐng)域權(quán)威期刊Archives of Toxicology上發(fā)表后得到關(guān)注,。后續(xù)又經(jīng)深入分析,，找到測(cè)序錯(cuò)誤主要來(lái)源于文庫(kù)制備中超聲引起的單鏈損傷，經(jīng)末端修復(fù)被固定，并應(yīng)用HPLC-MS技術(shù)對(duì)損傷產(chǎn)物的“Artifacts”進(jìn)行了確認(rèn),。據(jù)此優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后,，方法在準(zhǔn)確性和測(cè)序效率上已經(jīng)與“NanoSeq”技術(shù)相當(dāng)。與經(jīng)典的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)突變檢測(cè)技術(shù)相比,，在誘變劑檢測(cè)上具有更高靈敏性,。該技術(shù)使得人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體細(xì)胞上全基因組范圍的超低頻突變檢測(cè)成為可能。
PECC-Seq技術(shù)可在任意組織檢測(cè)單核苷酸突變頻率,，并獲得突變特征,，未來(lái)有望與其他毒性試驗(yàn)整合，替代經(jīng)典體內(nèi)致突變實(shí)驗(yàn),；除環(huán)境誘變劑外,，還可用于干細(xì)胞及其衍生細(xì)胞治療產(chǎn)品的安全性評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制，以及基因編輯技術(shù)中脫靶效應(yīng)的評(píng)價(jià)與研究,；結(jié)合DNA加合物組和暴露組分析,，整合動(dòng)物研究和人群研究，未來(lái)有望用于復(fù)雜環(huán)境因素與人類疾病的關(guān)聯(lián)及機(jī)理研究,；此外,，針對(duì)已知致癌物暴露的高危人群，有望用于健康風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)與疾病預(yù)防,；最后,，還可用于生命科學(xué)領(lǐng)域中衰老與發(fā)育研究領(lǐng)域，回答待解科學(xué)問(wèn)題,。
目前PECC-Seq技術(shù)已申請(qǐng)專利,，研究進(jìn)展在國(guó)際學(xué)術(shù)會(huì)議上多次進(jìn)行報(bào)告交流并獲得關(guān)注。相關(guān)論文的第一作者尤馨悅博士以該研究取得博士學(xué)位,，并獲得國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目和中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目的資助,。
新的遺傳學(xué)損傷效應(yīng)標(biāo)志——人群外周血PIG-A突變檢測(cè)技術(shù)
癌癥發(fā)病率逐年增高，如何預(yù)警和防治外源化學(xué)誘變劑對(duì)健康的危害是重要的科學(xué)問(wèn)題,。因絕大多數(shù)化學(xué)致癌物具有遺傳毒性,，因此以檢測(cè)遺傳學(xué)損傷為主的毒性效應(yīng)標(biāo)志應(yīng)用較為廣泛，目前常用的技術(shù)包括檢測(cè)DNA損傷的外周血彗星試驗(yàn)和檢測(cè)染色體損傷的外周血微核試驗(yàn),。突變和人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),，但是目前尚缺乏以檢測(cè)基因突變頻率為終點(diǎn)的人群監(jiān)測(cè)方法。
細(xì)胞表面存在的許多分化抗原通過(guò)糖基磷脂酰肌醇聚糖(GPI)錨連接在細(xì)胞表面,。磷脂酰肌醇聚糖A（Phosphatidylinositolglycan classA,，PIG-A）基因是GPI錨的編碼基因，且在與GPI錨合成相關(guān)的基因中,，只有PIG-A基因位于x染色體上,，因此，PIG-A基因單次突變即可導(dǎo)致該細(xì)胞GPI錨缺陷和表面相應(yīng)抗原缺失。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表型（相應(yīng)表面抗原是否缺失）來(lái)考察發(fā)生基因突變的細(xì)胞比例,，進(jìn)而計(jì)算PIG-A基因突變頻率,，可以評(píng)價(jià)受試物的致突變性。外周血是常用的生物學(xué)標(biāo)志檢測(cè)樣本,，骨髓造血干細(xì)胞如發(fā)生PIG-A基因突變,，將導(dǎo)致成熟血細(xì)胞表面相應(yīng)標(biāo)志缺失從而被檢測(cè)到。目前,，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上已驗(yàn)證該方法有效性,，2022年OECD組織將其列入法規(guī)，用于化學(xué)物臨床前致突變作用的評(píng)價(jià),。
據(jù)悉,，公共衛(wèi)生學(xué)院欒洋研究員作為OECD專家工作組成員參與了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Pig-a突變技術(shù)指南制訂，課題組于2016年開(kāi)始在國(guó)際上率先開(kāi)展了人群研究,。目前已建立檢測(cè)方法，并在致癌物職業(yè)暴露人群,、化療藥物治療患者上完成了方法驗(yàn)證,，結(jié)果表明該方法作為早期效應(yīng)標(biāo)志可用于致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。目前在開(kāi)展的應(yīng)用研究包括苯和多環(huán)芳烴職業(yè)暴露風(fēng)險(xiǎn)研究,。國(guó)際通行的苯職業(yè)暴露限值為1 ppm,，主要基于造血功能障礙和白血病風(fēng)險(xiǎn)。利用人群紅細(xì)胞PIG-A突變檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行研究和計(jì)算,，苯的安全濃度被確定為需低于0.07 ppm,，該數(shù)據(jù)為監(jiān)管機(jī)構(gòu)修訂苯的職業(yè)暴露接觸限值以進(jìn)行更早期風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警提供了重要參考。上述結(jié)果于2023年5月以題為 Benchmark dose estimation for benzene-exposed workers in China: Based on quantitative and multi-endpoint genotoxicity assessments的研究論文發(fā)表在權(quán)威期刊Environmental Pollution上,。此外,，在焦?fàn)t工隊(duì)列研究中也應(yīng)用PIG-A突變檢測(cè)技術(shù)對(duì)工人進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，上述結(jié)果于2023年6月以題為PIG-A gene mutation as a mutagenicity biomarker among coke oven workers”的研究論文在Food and Chemical Toxicology上發(fā)表,。綜上,，PIG-A基因突變頻率可以成為靈敏的效應(yīng)標(biāo)志用于人群風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。需要注意的是該技術(shù)無(wú)法獲得基因的突變特征,，因此結(jié)合PECC-Seq和相關(guān)內(nèi)暴露分析將是更好的研究策略,。系列論文第一作者為公共衛(wèi)生學(xué)院的曹易懿和奚晶老師。
開(kāi)發(fā)新技術(shù)絕不僅僅是為了論文發(fā)表,，技術(shù)只有被用起來(lái)才能獲得生命力,。期待未來(lái)有更多學(xué)科交叉與合作的開(kāi)展，將上述技術(shù)用于化合物/生物制品和環(huán)境因素的安全性評(píng)價(jià)和人群健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,，最終為監(jiān)管提供理論依據(jù),，解析復(fù)雜環(huán)境暴露的毒性機(jī)理，以及回答生命科學(xué)領(lǐng)域中一些待解科學(xué)問(wèn)題。
上海交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院欒洋研究員課題組研究方向?yàn)檫z傳毒理,，主要為新技術(shù)開(kāi)發(fā)和外源化合物毒性機(jī)理研究,。探索的新技術(shù)包括基于一致性測(cè)序的低頻突變檢測(cè)方法，新遺傳學(xué)損傷效應(yīng)標(biāo)志人外周血PIG-A基因突變?cè)囼?yàn),，基于微流控和微孔板體系的單線蟲(chóng)高通量毒性測(cè)試方法等,；此外，通過(guò)DNA加合物檢測(cè),、體外培養(yǎng)細(xì)胞DNA損傷,、染色體畸變和基因突變檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因突變檢測(cè)等體系,，結(jié)合分子生物學(xué)手段,，對(duì)環(huán)境污染物及中藥有毒成分進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)和機(jī)制研究。上述研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目支持（81873081,，82304267,，21477078，21077112,，20807045）,。部分研究與日本國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIHS）合作由上海交通大學(xué)主導(dǎo)完成。
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