近日，上海交通大學醫(yī)學院-國家熱帶病研究中心全球健康學院殷堃課題組在國際期刊Chemical Engineering Journal在線發(fā)表了題為“Spatiotemporal dual-dimensional separation enables ultra-simple one-pot CRISPR-based molecular diagnostics”的研究論文。該研究構建了一種基于時空雙維度分隔的一步法RPA-CRISPR病原體快速檢測平臺，通過設計物理屏障裝置，實現(xiàn)兩分隔體系自發(fā)動態(tài)融合，解決氣溶膠污染及體系不兼容問題，實現(xiàn)簡便、靈敏、特異的病原體檢測，為開發(fā)理想病原體檢測方法提供技術支撐。
近年來，基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的檢測方法已成為分子診斷技術開發(fā)重點。與等溫擴增方法如RPA聯(lián)用可提升基于CRISPR檢測的靈敏度，然而，分步法操作涉及擴增產(chǎn)物開蓋轉移步驟，增加氣溶膠污染的風險。因此，將RPA與CRISPR反應整合到一管式封閉體系中可避免此問題，但一管式檢測面臨兩體系不兼容問題，檢測效率顯著下降。為應對這一挑戰(zhàn)，已有研究建立時間或空間維度分隔的方法，先物理分隔或通過光降解引物分隔兩體系，后通過離心或光照操作使RPA與CRISPR反應混合，實現(xiàn)靈敏的一管式RPA-CRISPR檢測。然而，這些方法依賴中間操作實現(xiàn)分步反應，因此，一種簡便、自發(fā)進行的一管式檢測平臺仍然亟待開發(fā)。
為解決體系不兼容問題，本研究首先設計了一種“管中管”結構，通過3D打印技術設計并打印底部包含數(shù)個毛細通道的內管作為物理半屏障裝置，實現(xiàn)時空雙維度分隔并能自發(fā)進行的RPA-CRISPR一管式反應。內管底部作為物理屏障在空間維度分隔兩體系，同時，內管底部垂直貫穿的數(shù)個毛細通道將兩體系連接起來，隨著下方RPA反應進行，濃度逐漸增高的核酸擴增產(chǎn)物經(jīng)由毛細通道向上擴散至上方CRISPR體系中，與crRNA互補配對結合，激活Cas12a蛋白對熒光報告探針的反式切割活性，并產(chǎn)生熒光信號，以此形成時間維度分隔。這種基于時空雙維度分隔的一步法CRISPR/Cas檢測方法無需任何中間操作，反應開始后兩體系可逐漸自發(fā)動態(tài)融合，實現(xiàn)真正簡便的一步法檢測。該平臺被用于沙門氏菌檢測，表現(xiàn)出良好特異性及靈敏度，為開發(fā)理想病原體檢測方法提供技術支撐。
上海交通大學醫(yī)學院-國家熱帶病研究中心全球健康學院碩士研究生李慧敏為本文的第一作者，胡沁沁副研究員和殷堃研究員為本文的共同通訊作者。本研究得到國家自然科學基金項目、上海市自然科學基金項目、海南省重點研發(fā)項目等基金支持。
醫(yī)學院主頁
