近日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院-國家熱帶病研究中心全球健康學(xué)院殷堃課題組在分析化學(xué)領(lǐng)域頂刊《Analytical Chemistry》在線發(fā)表了題為“Enhanced Two-Step LAMP-CRISPR Assay with an Engineered Zst Polymerase for Contamination-Free and Ultrasensitive DNA Detection”（doi: 10.1021/acs.analchem.4c03965）的研究論文。該研究開發(fā)了一種增強(qiáng)型兩步法LAMP-CRISPR檢測(cè)策略，利用一種工程化Zst聚合酶突變體高效聚合四種寡核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和dUTP），無需添加dTTP即可高效完成LAMP反應(yīng)，并利用體系中預(yù)混的UDG酶徹底清除反應(yīng)環(huán)境中所有尿嘧啶-LAMP擴(kuò)增子形成的氣溶膠污染，從而實(shí)現(xiàn)超靈敏免污染DNA檢測(cè)，解決LAMP-CRISPR反應(yīng)中存在的假陽性干擾、反應(yīng)效率偏低、靈敏度不足等問題；進(jìn)一步將該方法在85例宮頸癌篩查患者的宮頸拭子樣本中進(jìn)行臨床驗(yàn)證，檢測(cè)精確度高達(dá)98.8%，實(shí)現(xiàn)了對(duì)臨床病原體的免污染、超靈敏即時(shí)診斷，該策略在臨床病原體、生物標(biāo)志物及其他關(guān)鍵生物靶標(biāo)的快速、靈敏診斷方面顯示了重大潛力。
近年來，CRISPR/Cas系統(tǒng)憑借其高效反式切割單鏈DNA或RNA的特性，展現(xiàn)出成為下一代分子診斷技術(shù)的巨大潛力。結(jié)合一系列核酸擴(kuò)增技術(shù)（如PCR、LAMP等）的CRISPR/Cas技術(shù)，特別是CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13，已被廣泛應(yīng)用于開發(fā)病原體的診斷新策略。其中，LAMP技術(shù)僅通過一種DNA聚合酶即可實(shí)現(xiàn)指數(shù)級(jí)等溫?cái)U(kuò)增，反應(yīng)簡單且擴(kuò)增高效，因此常與CRISPR技術(shù)結(jié)合實(shí)現(xiàn)兩步法或一步法核酸檢測(cè)。其中，兩步法LAMP-CRISPR中，LAMP試劑和CRISPR試劑互不干擾，因此保證了較高的反應(yīng)靈敏度，然而，LAMP反應(yīng)結(jié)束后需要進(jìn)行開蓋移液，這一操作不僅延長了反應(yīng)周轉(zhuǎn)時(shí)間，還可能導(dǎo)致高濃度擴(kuò)增子的氣溶膠污染，從而顯著增加假陽性風(fēng)險(xiǎn)。為了解決這一問題，研究人員將LAMP試劑和CRISPR試劑置于同一試管中，開發(fā)了一系列一管式LAMP-CRISPR方法。例如開發(fā)“兩步法一管式”LAMP-CRISPR策略，通過物理隔離兩步反應(yīng)試劑，預(yù)先將CRISPR試劑置于試管內(nèi)壁或管蓋，先進(jìn)行LAMP反應(yīng)，再通過離心或輕微搖晃試管觸發(fā)第二步CRISPR反應(yīng)；或者開發(fā)直接混合LAMP反應(yīng)試劑和CRISPR反應(yīng)試劑的“一步法一管式”LAMP-CRISPR策略等。然而，上述的一管式LAMP-CRISPR方法也存在一些弊端，例如操作穩(wěn)定性不佳造成的檢測(cè)結(jié)果不可靠、裝置密閉性不良導(dǎo)致的氣溶膠污染等問題；另外，由于LAMP和CRISPR反應(yīng)體系的不兼容性，一管式LAMP-CRISPR會(huì)犧牲一部分反應(yīng)效率和靈敏度，因此，需要開發(fā)更加高效、免污染的LAMP-CRISPR策略。
因此，為了徹底解決LAMP-CRISPR反應(yīng)存在的氣溶膠污染、靈敏度不佳等問題，本研究首次開發(fā)了一種基于突變型工程化Zst聚合酶的增強(qiáng)型兩步法LAMP-CRISPR檢測(cè)策略。該策略利用工程化的突變型Zst DNA聚合酶高效聚合四種寡核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和dUTP），無需添加dTTP即可實(shí)現(xiàn)高效的LAMP反應(yīng)。同時(shí)，通過預(yù)先加入的UDG酶消除環(huán)境中可能存在的尿嘧啶，從而徹底消除氣溶膠污染導(dǎo)致的假陽性干擾。本方法能夠在一小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)人乳頭瘤病毒的單拷貝檢測(cè)，精確度高達(dá)98.8%，與金標(biāo)準(zhǔn)qPCR相似，為臨床病原體、生物標(biāo)志物及其他重要靶標(biāo)的快速靈敏檢測(cè)提供了更簡便的解決思路，展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院-國家熱帶病研究中心全球健康學(xué)院碩士研究生解藝和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院江凱為本文的共同第一作者，上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科主任醫(yī)師施君、東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系丁雄研究員、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院-國家熱帶病研究中心全球健康學(xué)院殷堃研究員為本文的共同通訊作者，本研究得到了國家自然科學(xué)基金、上海市自然科學(xué)基金等基金支持。
Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.4c03965?ref=pdf
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