孤獨(dú)癥譜系障礙（Autism Spectrum Disorder），又稱自閉癥,，是一類嚴(yán)重影響兒童身心健康的神經(jīng)發(fā)育疾病，患者表現(xiàn)出嚴(yán)重程度不同的社交障礙以及重復(fù)刻板行為,。根據(jù)美國疾控中心統(tǒng)計(jì),，孤獨(dú)癥的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，最新的2022年美國孤獨(dú)癥患病率約為1/361,。中國對于6~12歲孤獨(dú)癥兒童患病率的統(tǒng)計(jì)顯示,，男孩約為0.44%~0.95%,，女孩約為0.12%~0.30%2。遺傳因素是孤獨(dú)癥致病的最主要因素,，近年來研究者們發(fā)現(xiàn)了大量的孤獨(dú)癥風(fēng)險(xiǎn)基因及致病基因突變3,4,，目前研究多集中在基因突變導(dǎo)致孤獨(dú)癥的分子與環(huán)路機(jī)制上，是否可以運(yùn)用基因編輯方法對導(dǎo)致孤獨(dú)癥的基因突變在大腦內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確的修復(fù)還未見報(bào)道,。
2023年11月27日,，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院松江研究院/中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）仇子龍團(tuán)隊(duì)與復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院程田林團(tuán)隊(duì)合作在國際神經(jīng)科學(xué)權(quán)威期刊Nature Neuroscience雜志上發(fā)表題為Whole-brain in vivo base editing reverses behavioral changes in Mef2c mutant mice的研究論文，首次報(bào)道了在全腦范圍內(nèi)利用單堿基編輯技術(shù)成功改善Mef2c孤獨(dú)癥小鼠模型神經(jīng)發(fā)育與孤獨(dú)癥樣核心行為表型,。
仇子龍研究團(tuán)隊(duì)通過全外顯子組測序技術(shù)在一例中國的孤獨(dú)癥患兒的MEF2C基因上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新發(fā)點(diǎn)突變（de novo mutation）, c.T104C, p.L35P, MEF2C基因已被證實(shí)是一個(gè)很重要的孤獨(dú)癥風(fēng)險(xiǎn)基因,，突變會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育遲滯及一系列嚴(yán)重癥狀5，但是該新發(fā)點(diǎn)突變對于MEF2C基因功能的影響未知,。研究團(tuán)隊(duì)首先利用分子細(xì)胞生物學(xué)的研究方法在體外探究了 L35P 點(diǎn)突變對 MEF2C 蛋白結(jié)構(gòu),、表達(dá)以及功能上的影響及其分子機(jī)制 (圖I和圖II)。 研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn) L35P 突變會(huì)導(dǎo)致 MEF2C 蛋白質(zhì)發(fā)生依賴泛素化蛋白酶體途徑的快速降解（圖II）,，最終顯著降低MEF2C蛋白的表達(dá)水平（圖I）,。
為了研究 L35P 基因突變對小鼠行為學(xué)表型的影響，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了Mef2c L35P 點(diǎn)突變敲入小鼠模型,，并通過生物化學(xué),、免疫熒光成像以及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)探究了其神經(jīng)發(fā)育及行為學(xué)表型。研究發(fā)現(xiàn)Mef2c L35P 雜合突變小鼠大腦中存在孤獨(dú)癥相關(guān)的神經(jīng)生理學(xué)特征以及發(fā)育異?，F(xiàn)象,，并且表現(xiàn)出社交障礙以及刻板行為等孤獨(dú)癥核心癥狀的行為學(xué)表型（圖III）。
隨后,，為了修復(fù)小鼠大腦神經(jīng)元中的L35P點(diǎn)突變,，仇子龍和程田林團(tuán)隊(duì)合作開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas9 的新型胞嘧啶單堿基編輯系統(tǒng)（APOBEC3A embedding Cytosine Base Editor，AeCBE,，已申請相關(guān)發(fā)明專利）,，使其能夠?qū)?/span>小鼠Mef2c基因中特定位置上異常的C·G堿基對轉(zhuǎn)換成正常的T·A堿基對。為了能夠使得新型CBE系統(tǒng)成功地跨越小鼠血腦屏障（blood brain barrier,， BBB）,，研究團(tuán)隊(duì)將AeCBE系統(tǒng)包裝進(jìn)PHP.eB血清型的腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）中,，并且利用單次小鼠尾靜脈注射AAV的遞送方式,，使得AeCBE系統(tǒng)在小鼠大腦中多個(gè)腦區(qū)得以成功表達(dá)。經(jīng)AeCBE系統(tǒng)編輯后,，研究團(tuán)隊(duì)在體內(nèi)檢測到較高的單堿基編輯效率以及低脫靶事件,，驗(yàn)證了新開發(fā)的AeCBE系統(tǒng)具備高效性、準(zhǔn)確性且安全性的特點(diǎn)（圖IV）。
最后,，研究團(tuán)隊(duì)檢測了經(jīng)過AeCBE系統(tǒng)介導(dǎo)的基因治療后Mef2c L35P突變雜合小鼠大腦中的神經(jīng)生理學(xué)變化以及行為學(xué)表型,。在經(jīng)過單堿基編輯技術(shù)介導(dǎo)的基因修復(fù)后，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)Mef2c L35P突變雜合小鼠大腦中降低的Mef2c蛋白表達(dá)水平得到恢復(fù),，并且其社交障礙以及重復(fù)刻板性行為也得到了明顯的改善,。
本工作提出了利用具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的單堿基編輯系統(tǒng)在全腦水平修復(fù)單核苷酸致病突變的體內(nèi)基因編輯策略，為設(shè)計(jì)神經(jīng)遺傳疾病的基因編輯干預(yù)治療方案提供了全新思路,。
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院松江研究院/中國科學(xué)院腦智卓越中心仇子龍研究員和復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院程田林研究員為該論文共同通訊作者,。中國科學(xué)院腦智卓越中心李維克博士，復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院博士生張淑倩為該論文共同第一作者,。中國科學(xué)院腦智卓越中心彭婉玲,、石玉含、袁博,、袁依婷,、王錦程、韓文建,、陳枝芳,、單仕芳、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院薛震宇,、復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院陳金龍,、張成以及復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院薛碧清對該工作做出重要貢獻(xiàn)。該研究工作得到了中國科學(xué)院腦智卓越中心許曉鴻研究員,、竺淑佳研究員,、臨港實(shí)驗(yàn)室徐華泰研究員和復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院邰一琳研究員的重要指導(dǎo)。該研究工作還得到了中國科學(xué)院腦智卓越中心分子細(xì)胞平臺(tái),，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)與光學(xué)成像平臺(tái)大力支持,。
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院松江研究院仇子龍研究員實(shí)驗(yàn)室（http://dripwizz.com/sri/kxyj/yjdw1/js/czl.htm）長期致力于孤獨(dú)癥的神經(jīng)生物學(xué)研究工作，從孤獨(dú)癥的遺傳學(xué)分析,、神經(jīng)發(fā)育機(jī)制,、分子神經(jīng)生物學(xué)與基因編輯干預(yù)等方面開展工作，長期招收相關(guān)專業(yè)博士后,，請有志學(xué)子與仇子龍研究員直接聯(lián)系（[email protected]）,。
復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院程田林研究員實(shí)驗(yàn)室（https://itbr.fudan.edu.cn/info/1202/1805.htm）致力于基因編輯技術(shù)研發(fā)及各類遺傳病基因治療研究，長期招收相關(guān)專業(yè)博士后,，請有志學(xué)子與程田林研究員直接聯(lián)系（[email protected]）,。
圖I: L35P點(diǎn)突變顯著降低MEF2C蛋白表達(dá)水平。
圖II：L35P點(diǎn)突變通過泛素化蛋白酶體降解途徑介導(dǎo)MEF2C蛋白翻譯后快速降解,。
圖III：Mef2c L35P雜合小鼠表現(xiàn)出與孤獨(dú)癥相關(guān)的異常神經(jīng)發(fā)育,，突觸密度降低,，抑制性中間神經(jīng)元數(shù)量下降及異常的電生理表型，且出現(xiàn)孤獨(dú)癥相關(guān)的行為學(xué)表型,。
圖IV： 基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)開發(fā)的新型胞嘧啶單堿基編輯系統(tǒng)，通過體內(nèi)及體外驗(yàn)證了其在目標(biāo)靶點(diǎn)的堿基編輯效率以及脫靶事件,，證明該系統(tǒng)是高效,，準(zhǔn)確且安全的。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41593-023-01499-x
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同行專家評論：牛煦然博士,，魏文勝教授（北京大學(xué)）
孤獨(dú)癥譜系障礙（Autism spectrum disorder, ASD）（亦稱“自閉癥”）是一類神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病,，患者往往有社交、語言等方面的障礙,，并會(huì)存在重復(fù)刻板的行為,。隨著1988年著名電影Rain Man的上映，這一疾病更加為人所知,。目前,，ASD已被明確報(bào)道存在高度遺傳傾向。在包括中國和韓國在內(nèi)的東亞ASD人群隊(duì)列研究中,，MEF2C這一基因的突變已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和ASD發(fā)病相關(guān),。MEF2C在小鼠神經(jīng)元分化、神經(jīng)發(fā)育和突觸可塑性中發(fā)揮著重要作用,，暗示這一基因可能通過影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育而產(chǎn)生ASD疾病表型,。
近日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院松江研究院/中科院腦智卓越中心仇子龍課題組與復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院程田林課題組合作在Nature Neuroscience上發(fā)表了題為Whole-brain in vivo base editing reverses behavioral changes in Mef2c mutant mice的研究論文,。該文章通過全外顯子組測序在患者中發(fā)現(xiàn)了MEF2C基因上的一個(gè)de novo SNV（c.104T > C, p.L35P）,，并證實(shí)了該突變會(huì)影響MEF2C的泛素化降解途徑進(jìn)而影響蛋白水平。MEF2C-L35P敲入的雜合小鼠會(huì)出現(xiàn)明顯的新事物識(shí)別障礙,、多動(dòng),、重復(fù)行為等ASD表型。由于該突變恰好可以被胞嘧啶堿基編輯器CBE所糾正,，因此研究人員使用優(yōu)化的APOBEC內(nèi)嵌型CBE（AeCBE）結(jié)合雙AAV遞送的方式對Mef2c L35P+/-小鼠進(jìn)行了in vivo基因編輯治療,，成功糾正了小鼠所存在的類ASD疾病表型。
本論文可圈可點(diǎn)之處,，第一是在小鼠上精確模擬了人群中存在的SNV并得到了相似的ASD表型,，為進(jìn)一步的研究提供了良好的模型基礎(chǔ)；第二是使用優(yōu)化的AeCBE進(jìn)行編輯,，不僅比AncBE4等編輯器效率更高,，還使用了PAM為NGN的SpG Cas9，拓寬了編輯器的使用范圍,；第三是使用了可以突破血腦屏障的AAV-PHP.eB,，高效地將編輯系統(tǒng)遞送至小鼠全腦,；第四是概念上證明了堿基編輯器可以通過一次給藥的方式，對腦部遺傳疾病進(jìn)行精準(zhǔn)且有效的基因治療,，為未來ASD及相關(guān)遺傳疾病治療提供了良好的思路與范式,。近期，仇子龍課題組還和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院李斐團(tuán)隊(duì)報(bào)道了中國孤獨(dú)癥人群的大規(guī)模全外顯子遺傳學(xué)研究,。研究中所鑒定的多個(gè)高置信度的ASD候選基因及對應(yīng)的相關(guān)突變都有使用相似策略進(jìn)行研究和治療的價(jià)值,。在今年3月，David Liu課題組也在Science上發(fā)文,，使用雙AAV9載體遞送ABE編輯系統(tǒng)對脊髓型肌萎縮癥（SMA）小鼠進(jìn)行了治療,。該策略主要針對脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，同樣可以實(shí)現(xiàn)一次給藥,，終身治愈的目的,。
當(dāng)然在未來，對于腦部遺傳病的基因治療還可以有更多優(yōu)化選擇策略,，比如針對需編輯的致病位點(diǎn)多樣性,，可以選擇不同PAM的Cas9進(jìn)一步拓寬使用范圍；可以使用AAV-PHP.eB進(jìn)一步優(yōu)化得到的AAV.CAP-B10血清型進(jìn)行更為高效精準(zhǔn)的神經(jīng)元遞送,，或針對具體需求使用AAV-MG1.2等更加親和小膠質(zhì)細(xì)胞的血清型進(jìn)行遞送,。除CBE之外，ABE編輯系統(tǒng)以及近期報(bào)道的多個(gè)基于ABE系統(tǒng)TadA脫氨酶進(jìn)化得到的新型CBE,、CGBE,、ACBE等編輯工具均有望在遺傳疾病的治療中得到應(yīng)用?；?/span>ABE系統(tǒng)的編輯器整體安全性（包括脫靶效應(yīng)在內(nèi)）比CBE更好,，且有的變體具有良好的A5、C5等位置的窄窗口編輯效果,，對于以治療為目的精準(zhǔn)編輯更為有利,。與此同時(shí)，由于ABE的整體系統(tǒng)更小,，可以包裝入單個(gè)AAV內(nèi),，因此ABE系統(tǒng)和如直接進(jìn)化TadA所得到的TadCBEs工具也有極大的in vivo基因治療潛力。
或許在未來,，我們身邊的Rain Man,，可以在飛速發(fā)展的基因編輯工具的應(yīng)用浪潮中，擁有Healthy Brain,，成為走出孤獨(dú)世界的Brave Man,。
同行專家評論：李大力教授（華東師范大學(xué)）
人類致病性遺傳突變中有近6成為點(diǎn)突變，雖然基于CRISPR的HDR技術(shù)提供了堿基突變修復(fù)的可操作性,，但受外源模板,、修復(fù)機(jī)制等影響,，HDR的編輯效率仍非常有限。此外,，HDR介導(dǎo)的基因編輯往往依賴于細(xì)胞分裂,，其應(yīng)用潛力更加受限。近年來,， CRISPR衍生技術(shù)-堿基編輯器（BE）已成為廣受歡迎的堿基高效替換工具,，它主要由Cas蛋白與脫氨酶或DNA損傷修復(fù)酶構(gòu)成，如CBE, ABE, CGBE/GBE 以及最近開發(fā)的腺嘌呤顛換編輯器（AYBE, AXBE, ACBE）等,。因無需依賴外源模板和DSB，理論上也不依賴于細(xì)胞分裂,，堿基編輯技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域,，特別是基于血紅蛋白病、早衰癥,、視網(wǎng)膜病變,、神經(jīng)肌肉病、心肌病,、耳聾等疾病的基因治療,。
遺傳變異是導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素，因此能精準(zhǔn)修復(fù)致病突變的基因編輯技術(shù)在其中的治療潛力也廣受關(guān)注,?？紤]到神經(jīng)元在出生后很快失去分裂能力的特點(diǎn)，BE較HDR在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中更具有應(yīng)用的潛力和可行性,，但BE是否真能用于逆轉(zhuǎn)大腦的致病突變而治療神經(jīng)發(fā)育障礙疾?。ㄈ缱蚤]癥），目前尚未有相關(guān)報(bào)道,。
近期發(fā)表在Nature Neuroscience的工作中,，仇子龍和程田林團(tuán)隊(duì)合作首次鑒定了一個(gè)誘發(fā)自閉癥的罕見致病點(diǎn)突變(c.104T>C, p.L35P)，該位點(diǎn)位于MEF2C基因MADS結(jié)構(gòu)域上,，對于維持MEF2C蛋白穩(wěn)定性以及神經(jīng)元發(fā)育非常重要,。研究者還發(fā)現(xiàn)，攜帶該致病點(diǎn)突變的小鼠中也出現(xiàn)了神經(jīng)發(fā)育異常和自閉癥樣的行為表型,，表明成功獲得了自閉癥疾病模型,。為實(shí)現(xiàn)該致病位點(diǎn)的有效糾正，作者結(jié)合Cas9廣譜突變體SpG,、脫氨酶APOBEC3A的高安全性突變體以及內(nèi)部嵌入策略,，開發(fā)出了新型CBE工具-AeCBE。通過與經(jīng)典的CBE進(jìn)行對比,，作者發(fā)現(xiàn)AeCBE在含有致病突變的小鼠原代皮層神經(jīng)元中具有最優(yōu)的胞嘧啶轉(zhuǎn)換編輯效率,，證實(shí)了堿基編輯器用于非分裂細(xì)胞神經(jīng)元致病突變修復(fù)的可行性,。最后使用內(nèi)含肽介導(dǎo)的拆分策略以及穿過血腦屏障(BBB)的AAV-PHPeB系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)遞送，發(fā)現(xiàn)AeCBE在全腦Mef2c產(chǎn)生了高效的C-to-T編輯（~20%）且具有較低的脫靶風(fēng)險(xiǎn),。該治療能有效恢復(fù)Mef2c蛋白的表達(dá)水平,，并有效改善了自閉癥小鼠的突觸功能和社交能力，也顯著降低了重復(fù)刻板行為的出現(xiàn),。
總之,，這項(xiàng)工作發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致自閉癥的MEF2C致病新突變，探索了新突變的致病機(jī)理,，還創(chuàng)新性開發(fā)出高效且更少旁觀者突變的AeCBE系統(tǒng),，最終通過在體全腦堿基編輯首次實(shí)現(xiàn)了自閉癥小鼠的有效治療。該研究為自閉癥治療提供了新的思路,，并進(jìn)一步表明了堿基編輯技術(shù)治療遺傳性腦部疾病的巨大潛力,。
同行專家評論：朱俊杰博士、陳佳研究員（上?？萍即髮W(xué)）
自閉癥譜系障礙（ASD）是一種具有高度遺傳性的神經(jīng)發(fā)育障礙,，表現(xiàn)為社交缺陷，以及重復(fù)或受限的行為1,2,。目前為止,，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已批準(zhǔn)使用一些非典型抗精神病藥物治療自閉癥患者，例如利培酮（Risperdal）和阿立哌唑（Abilify）,，但往往伴隨著一些副作用,。
有研究結(jié)果表明，MEF2C基因在成年小鼠的大腦皮質(zhì),、海馬體和杏仁核中大量表達(dá)3,，其能夠調(diào)節(jié)突觸可塑性和谷氨酸能突觸的數(shù)量，是ASD相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)基因之一4,。MEF2C的突變會(huì)導(dǎo)致兒童大腦發(fā)育缺陷,，其特征為精神運(yùn)動(dòng)障礙，缺乏言語,，異常運(yùn)動(dòng)模式等5,6,。
基于CRISPR/Cas9的基因編輯系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于研究和治療各種遺傳疾病，如遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素淀粉樣變性（hATTR）7,、遺傳性血管性水腫（HAE）,、阿爾茲海默癥（AD）8和亨廷頓舞蹈癥（HD）9等。但堿基編輯仍沒有得到廣泛應(yīng)用,，尤其在神經(jīng)發(fā)育障礙治療領(lǐng)域,。
仇子龍/程田林團(tuán)隊(duì)在最新發(fā)表的論文 Whole-brain in vivo base editing reverses behavioral changes in Mef2c mutant mice，為遺傳性神經(jīng)發(fā)育障礙的治療提供了新的思路,。研究團(tuán)隊(duì)首先在ASD患者中鑒定出MEF2C基因中一種新的SNV(c.104T>C, p.L35P),，構(gòu)建了Mef2c L35P+/-自閉癥譜系障礙小鼠模型,，并進(jìn)一步研究Mef2c L35P突變對小鼠的影響。為了糾正這一突變,，研究團(tuán)隊(duì)在SpG蛋白內(nèi)部融合了人胞苷脫氨酶APOBEC3A-Y130F10和尿嘧啶糖苷酶抑制劑（UGI）,，從而構(gòu)建了一種新的CBE工具- AeCBE。其具有編輯效率高,，旁觀者編輯（bystander）和脫靶編輯（off-target editing）低等優(yōu)點(diǎn),。隨后，作者們采用可穿過血腦屏障的雙AAV系統(tǒng)（AAV-PHP.eB）和內(nèi)含肽介導(dǎo)的拆分策略,，將AeCBE系統(tǒng)遞送至Mef2c L35P+/-小鼠模型中,。通過NGS、免疫染色,、行為學(xué)分析,，電生理等手段，驗(yàn)證了AeCBE能夠在小鼠模型中高效編輯靶向位點(diǎn),，并糾正Mef2c L35P+/-小鼠的自閉癥行為。
目前,，自閉癥的治療是醫(yī)學(xué)中的難點(diǎn)之一,，尚沒有特效藥能夠治療自閉癥。而在本研究中,，作者們在前期報(bào)道的hA3A-BE3-Y130F堿基編輯器的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一種新的CBE系統(tǒng),，能夠在ASD小鼠模型中糾正MEF2C(c.104T>C)點(diǎn)突變，并糾正其自閉癥行為,。雖然ASD的成因極其復(fù)雜,，但這項(xiàng)研究證明了體內(nèi)堿基編輯在神經(jīng)發(fā)育障礙治療中的潛力，同時(shí)也為其他類型的堿基編輯器在腦內(nèi)遞送以及編輯帶來了新的啟發(fā),。
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