N6-甲基脫氧腺嘌呤（6mA）是DNA腺嘌呤6號位氮原子上的甲基化修飾，在多種生命體中具有重要的生物學(xué)調(diào)控功能（圖1a）。最初，6mA被發(fā)現(xiàn)主要存在于原核生物基因組中，用于區(qū)分自身基因組和外源DNA，保護(hù)自身DNA不被限制性內(nèi)切酶性降解。近年來，6mA逐漸被發(fā)現(xiàn)存在于真菌、衣藻、果蠅和哺乳動物等真核生物基因組（gDNA）和線粒體DNA（mtDNA）中，其動態(tài)水平的變化調(diào)控了早期胚胎發(fā)育及線粒體轉(zhuǎn)錄，提示6mA是真核生物基因組中繼5-甲基胞嘧啶（5mC, DNA甲基化）之后的又一個全新的表觀遺傳修飾，闡明其甲基化酶和去甲基化酶的分子機(jī)制對于深入理解6mA的基本生物學(xué)功能具有重要意義。
2022年6月2日，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院張良研究員團(tuán)隊聯(lián)合上海中醫(yī)藥大學(xué)陳紅專教授團(tuán)隊在Nature Chemical Biology雜志上發(fā)表了題為“A fungal dioxygenase CcTet serves as a eukaryotic 6mA demethylase on duplex DNA”的研究論文，發(fā)現(xiàn)真菌雙加氧酶CcTet是一種真核生物dsDNA 6mA去甲基化酶。灰蓋鬼傘菌（Coprinopsis cinerea）是一種常見的真菌蘑菇，其基因組上存在大量的5mC和6mA修飾，且隨著其生長周期變化呈現(xiàn)動態(tài)分布。張良研究員前期工作中已發(fā)現(xiàn)灰蓋鬼傘菌雙加氧酶CcTet通過將基因組上5mC逐步氧化成5hmC、5fC和5caC來參與DNA 5mC去甲基化調(diào)控（JACS, 2014, 136, 4801-4804）。目前研究工作進(jìn)一步揭示了CcTet識別和催化dsDNA上6mA底物的分子機(jī)制，并發(fā)展了具有6mA去甲基化活性的單功能CcTet突變體D337F，為進(jìn)一步研究真核生物6mA的調(diào)控機(jī)制和功能提供了新的化學(xué)生物學(xué)工具。Nature Chemical Biology在同期還配發(fā)了專家點評文章，對該工作進(jìn)行了詳細(xì)介紹和評論。
通過對CcTet潛在底物進(jìn)行大量篩選，發(fā)現(xiàn)CcTet對dsDNA上的6mA具有顯著的去甲基化活性（圖1b），并對C-6mA-G序列具有更高的底物偏好性，這與之前報道的多種真核生物基因組6mA motif序列吻合。同時，CcTet在體外（灰蓋鬼傘菌gDNA和綠藻gDNA）和體內(nèi)（大腸桿菌中異源表達(dá)）也表現(xiàn)出了較高的基因組6mA去甲基化活性。
為闡明CcTET的6mA去甲基化分子機(jī)制，進(jìn)一步解析了CcTet及CcTet與含有6mA修飾的短鏈dsDNA的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，揭示CcTet通過3個柔性Loop區(qū)域特異識別dsDNA，并利用活性袋中兩個關(guān)鍵氨基酸Gly331和Asp337選擇性識別和催化6mA堿基的分子機(jī)制（圖1c）。同時，通過與人源5mC去甲基化關(guān)鍵雙加氧酶TET2比較發(fā)現(xiàn)，TET2活性口袋中與CcTet Gly331對應(yīng)的氨基酸Asn1387側(cè)鏈阻擋了TET2對6mA底物的容納，將TET2 Asn1387突變成無側(cè)鏈的Glycine，則能使TET2獲得6mA的去甲基化活性。此外，通過與RNA m6A去甲基化酶FTO比較則發(fā)現(xiàn)，CcTet與FTO采用了截然不同的核酸單雙鏈識別機(jī)制，底物堿基進(jìn)入活性口袋的方向也因此發(fā)生了約90度的變化，造成FTO不能催化dsDNA的6mA去甲基化。
為獲得具有區(qū)分dsDNA上5mC和6mA底物的單功能6mA去甲基化酶，開展了基于結(jié)構(gòu)的定向進(jìn)化篩選，通過對活性口袋中關(guān)鍵氨基酸突變體進(jìn)行活性篩選和Dot blot實驗驗證，發(fā)現(xiàn)CcTet D337F在保持6mA去甲基化活性的同時，喪失了對5mC的催化活性。因此，CcTet D337F可以被進(jìn)一步開發(fā)成能特異性作用于6mA而不受其他修飾（如5mC）干擾的化學(xué)生物學(xué)新手段（圖1d）。
圖1. dsDNA 6mA去甲基化酶CcTet的分子機(jī)制
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)和化學(xué)生物學(xué)系張良研究員、上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市中藥化學(xué)生物學(xué)前沿科學(xué)基地陳紅專教授和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士后張琳為該論文的共同通訊作者。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院20級博士生穆雅娟、博士后張琳和21級博士生胡靜燕為該論文的共同第一作者。該研究工作受到芝加哥大學(xué)何川教授、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院林厚文教授和南京師范大學(xué)劉中華教授等指導(dǎo)和大力支持。研究工作獲得國家自然科學(xué)基金委“生物大分子動態(tài)修飾與化學(xué)干預(yù)”重大研究計劃、國家自然科學(xué)基金委優(yōu)秀青年基金和上海市教委曙光計劃等項目資助。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41589-022-01041-3
