脂滴作為細胞內(nèi)脂質(zhì)儲存細胞器，參與維持細胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，具有動態(tài)響應能量代謝需求的功能，其功能障礙與多種代謝疾病密切相關，如非酒精性脂肪性肝病、糖尿病、肥胖等。脂滴是高度動態(tài)的細胞器，在生成與成熟過程中可通過三種途徑進行擴張：（1）脂滴融合；（2）從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉運中性脂；（3）脂滴表面中性脂質(zhì)原位合成。近年來，針對脂滴生長調(diào)控的研究越來越多，但脂滴融合的分子機制仍然不清楚。
SNAREs(可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體)是一類具有SNARE結構域的家族蛋白。組成SNARE復合物的SNAREs蛋白錨定在相鄰的膜結構上，它們的SNARE結構域能夠自發(fā)從N端到C端拉鏈式組裝成四束螺旋體，引發(fā)膜融合。SNAREs已經(jīng)被證明參與多種物種的不同膜性細胞器的融合過程，比如Vam3-Vti1-Vam7-Nyv1介導了酵母的液泡同型融合，STX1-SNAP25-VAMP2介導了哺乳動物神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中突觸小泡與質(zhì)膜的融合，STX17-SNAP29-VAMP8以及YKT6-SNAP29-STX7驅動了細胞自噬過程中自噬體與溶酶體的融合。但對于SNARE復合物是否也介導了脂滴融合過程一直未有定論。
11月21日，上海交通大學醫(yī)學院病理生理學系鐘清、留筱廈課題組與華中科技大學丁彬彬課題組在Cell Discovery在線發(fā)表題為Qa-SNARE syntaxin 18 mediates lipid droplet fusion with SNAP23 and SEC22B的合作研究論文，發(fā)現(xiàn)SNARE蛋白STX18、SNAP23、SEC22B可組裝成SNARE復合物，調(diào)控脂滴動態(tài)，并進一步建立了全新的體外脂滴融合體系，直接證明了SNARE復合物介導脂滴融合的分子機制。
為了鑒定調(diào)控脂滴融合的SNAREs，研究團隊利用siRNA篩選并結合蛋白質(zhì)組學，發(fā)現(xiàn)Qa SNARE STX18、Qbc SNARE SNAP23、R SNARE SEC22B的缺失影響細胞內(nèi)脂滴的大小，但并不影響脂質(zhì)的生成、脂肪酸的攝取、脂解。此外，這三個SNAREs蛋白存在形成一套完整的SNARE復合物的可能性。因此，研究團隊猜測細胞內(nèi)存在STX18-SNAP23-SEC22B復合物，可參與調(diào)控脂滴融合。接著，研究團隊利用內(nèi)源性co-IP技術和一系列體外生化手段證明了這三個SNARE蛋白之間存在相互作用，可在體外組裝形成穩(wěn)定的SNARE復合物。利用共聚焦顯微鏡以及免疫金電鏡技術，研究團隊確認了SNAREs在脂滴表面的定位，并且首次建立脂滴蛋白半胱氨酸標記實驗，直接證明了膜蛋白STX18的跨膜結構域通過兩次跨膜錨定于脂滴表面。
由于在體內(nèi)難以實現(xiàn)針對膜融合過程的實時監(jiān)測，尤其是脂滴這一動態(tài)變化極其頻繁的細胞器，研究團隊嘗試在體外生化重建脂滴融合這一生物學過程。研究團隊首先建立了基于FRET（熒光能量共振轉移）的人工脂滴Lipid mixing assay，證明了STX18-SNAP23-SEC22B的截短體和全長復合物可介導人工脂滴Lipid mixing。由于體外脂滴Lipid mixing assay中標記的是脂滴的磷脂單分子層，Lipid mixing assay不足以完全表征融合的發(fā)生。接著，研究團隊首次合成了Cy3-DAG和Cy5-DAG來標記脂滴的內(nèi)部，建立了基于FRET的人工脂滴Content mixing assay，并結合DLS（動態(tài)光散射技術）和Cyro-EM（冷凍電鏡），直接證明了STX18-SNAP23-SEC22B介導了脂滴融合的發(fā)生。進一步地，研究團隊發(fā)現(xiàn)已被報道過的脂滴融合相關蛋白CIDEC/FSP27與SNAREs之間存在互作和共定位，并且全長的CIDEC/FSP27在體外可促進SNARE介導的脂滴融合的發(fā)生，結合DLS assay，研究團隊猜測CIDEC/FSP27在體外作為Tether橋連了相鄰的脂滴，促進SNARE介導的脂滴融合。
那么，SNARE缺失影響脂滴融合的生理意義是什么呢？研究團隊通過AAV敲低小鼠肝臟內(nèi)STX18，發(fā)現(xiàn)STX18的敲低可以緩解高脂飲食誘導的小鼠肝臟脂質(zhì)沉積。這與之前報道的敲低脂滴融合相關蛋白FSP27或Rab8a可緩解非酒精性脂肪性肝病類似。因此，研究團隊的發(fā)現(xiàn)進一步提示了脂滴融合的穩(wěn)態(tài)對于脂質(zhì)有效儲存的重要性。
圖注：Qa SNARE STX18、Qbc SNARE SNAP23和R SNARE SEC22B形成SNARE復合物，使相鄰的脂滴膜結構受擠壓發(fā)生形變，導致磷脂分子的重新排列，驅動脂滴融合。CIDEC/FSP27可通過介導脂滴聚集以及與SNAREs相互作用促進SNAREs介導的脂滴融合。
鐘清課題組的傅宇輝博士，丁彬彬教授，留筱廈副研究員為本文共同第一作者，鐘清研究員，丁彬彬教授，留筱廈副研究員為本文的共同通訊作者。
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https://www.nature.com/articles/s41421-023-00613-4
