2024年10月31日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所吳學(xué)鋒課題組聯(lián)合李斌課題組在The Journal of Clinical Investigation雜志在線（In-Press Preview）發(fā)表了題為“TMED4 facilitates Treg suppressive function via ROS homeostasis in tumor and autoimmune mouse models”的研究論文。該研究揭示了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白TMED4通過(guò)介導(dǎo)IRE1α-XBP1信號(hào)軸依賴(lài)的細(xì)胞活性氧（ROS）水平維持調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞的Foxp3穩(wěn)定性及免疫抑制功能的作用機(jī)制。通過(guò)IRE1α -XBP1信號(hào)通路和NRF2相關(guān)的抗氧化反應(yīng)，TMED4促進(jìn)Treg細(xì)胞ROS穩(wěn)態(tài)，從而維持細(xì)胞Foxp3的表達(dá)及抑制功能。缺失TMED4的Treg細(xì)胞在小鼠腫瘤模型和自身免疫疾病模型中均促進(jìn)了效應(yīng)性T細(xì)胞的活化，進(jìn)而提高抗腫瘤免疫力或加重自身免疫疾病癥狀。
調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）作為CD4+T細(xì)胞的獨(dú)特亞群，具有免疫抑制功能，維持免疫穩(wěn)態(tài)。Treg細(xì)胞重要標(biāo)志是表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，后者調(diào)控Treg細(xì)胞的分化和功能。炎癥微環(huán)境及誘導(dǎo)慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）的藥物可能導(dǎo)致Foxp3蛋白穩(wěn)定性受損，使Treg轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)T細(xì)胞樣表型，從而促進(jìn)自身效應(yīng)性T細(xì)胞和其它先天免疫細(xì)胞的激活，這一轉(zhuǎn)變成為許多自身免疫疾病出現(xiàn)的導(dǎo)火索。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控Foxp3穩(wěn)定性和Treg功能的機(jī)制不清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是分泌蛋白折疊和質(zhì)量控制的中心，錯(cuò)誤折疊的蛋白通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（ERAD）途徑被識(shí)別并降解。在應(yīng)激條件下，未折疊或者錯(cuò)誤折疊的蛋白的積累激活三條內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通路：IRE1α、PERK和ATF6，其中IRE1α被認(rèn)為是ERAD復(fù)合體的內(nèi)源性底物，其降解涉及E3泛素連接酶HRD1和未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）分子伴侶BIP。IRE1α 在Treg細(xì)胞中由ERAD介導(dǎo)的降解機(jī)制仍待探討。已有研究表明酵母p24蛋白（TMED4）可以防止錯(cuò)誤折疊的蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌的囊泡，并且其表達(dá)能被多種ERS誘導(dǎo)劑激活，TMED4是否參與Treg細(xì)胞ERS調(diào)控及其具體機(jī)制仍然不為所知。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)在T細(xì)胞和Treg細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用。與其他CD4+T細(xì)胞不同，Treg細(xì)胞主要依賴(lài)線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）來(lái)滿足其能量需求；另外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和線粒體OXPHOS缺陷是細(xì)胞活性氧（ROS）的主要來(lái)源，抗氧化轉(zhuǎn)錄因子NRF2參與清除ROS。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的UPR高度依賴(lài)氧化還原信號(hào)的響應(yīng)，線粒體OXPHOS和細(xì)胞ROS水平的波動(dòng)將對(duì)Treg細(xì)胞的功能至關(guān)重要，并且Treg細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、線粒體OXPHOS和抗氧化反應(yīng)之間的相互作用機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也需深入探索。
圖1.在人的多種腫瘤中，TMED4與腫瘤浸潤(rùn)Treg細(xì)胞ERS相關(guān)基因和FOXP3表達(dá)呈正相關(guān)
本研究對(duì)癌癥基因組圖譜（TCGA）的多種癌癥數(shù)據(jù)集（結(jié)腸癌（COAD）、直腸癌（READ）、肺腺癌（LUAD）、肝癌（LIHC）和胃癌（STAD））基因表達(dá)譜進(jìn)行的相關(guān)性分析，揭示了ERS相關(guān)基因的表達(dá)譜以及Treg標(biāo)志基因的表達(dá)譜與TMED4之間存在很強(qiáng)的正相關(guān)性。此外，對(duì)人類(lèi)結(jié)直腸癌、胃癌和腎癌樣本中分選出的CD4+CD25highTreg 細(xì)胞進(jìn)行的mRNA表達(dá)相關(guān)性分析結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，TMED4的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)Treg細(xì)胞的ERS激活相關(guān)基因和FOXP3表達(dá)高度正相關(guān)（圖1）。
圖2. Tmed4缺失以細(xì)胞內(nèi)在的方式下調(diào)Treg細(xì)胞的特征圖譜和其體外抑制功能
為進(jìn)一步探討TMED4通過(guò)ERS參與調(diào)控Treg細(xì)胞功能的機(jī)制，作者通過(guò)對(duì)比野生型和Tmed4在Treg中特異性敲除小鼠（Tmed4ΔTreg）的表型，發(fā)現(xiàn)Tmed4ΔTreg小鼠相比于野生型小鼠表現(xiàn)出脾臟腫大、體重下降以及非淋巴器官淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增加等自身炎癥表型，流式分析顯示Tmed4ΔTreg小鼠淋巴器官中T細(xì)胞高度活化且分泌更多的炎癥因子IFN-γ和IL-17。此外，本研究通過(guò)RNA-seq、體外抑制實(shí)驗(yàn)、骨髓過(guò)繼轉(zhuǎn)移模型（Bone marrow chimera）和嵌合體雌性小鼠模型（Female Chimera）等綜合驗(yàn)證了TMED4以細(xì)胞內(nèi)在的方式在維持Treg細(xì)胞Foxp3以及其他重要Treg表征分子的穩(wěn)定表達(dá)和正常抑制功能中發(fā)揮著重要作用。為探究Tmed4缺失對(duì)Treg細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)病理生理的影響，本研究利用實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型（EAE）、T細(xì)胞誘導(dǎo)的慢性腸炎模型（T cell-induced chronic colitis）以及MC38皮下瘤小鼠模型，揭示了Tmed4缺失會(huì)促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞，尤其是Th1和CD8+T細(xì)胞的活化，導(dǎo)致小鼠自身免疫性炎癥的惡化和促進(jìn)抗腫瘤免疫。
圖3. ROS清除劑或NRF2誘導(dǎo)劑可回補(bǔ)Foxp3的表達(dá)和Tmed4缺失的Treg細(xì)胞的抑制功能
研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Tmed4的缺失顯著下調(diào)IRE1α蛋白水平及其下游XBP1信號(hào)通路。Seahorse實(shí)驗(yàn)揭示了Tmed4缺失導(dǎo)致Treg細(xì)胞線粒體受損，使其更依賴(lài)于糖酵解途徑而非氧化磷酸化，胞內(nèi)總體ROS及線粒體ROS水平明顯上調(diào)。通過(guò)ROS清除劑NAC以及NRF2誘導(dǎo)劑均能夠在體內(nèi)外有效回補(bǔ)Treg細(xì)胞Foxp3的表達(dá)和抑制功能（圖3）。此外，本研究還通過(guò)Ern1ΔTreg（Treg中特異性缺失IRE1α）小鼠、IRE1α 通路抑制劑（4μ8C和KIRA6）處理、IRE1α 蛋白回補(bǔ)（Sindbis病毒過(guò)表達(dá)）以及PERK通路抑制（siRNA抑制PERK表達(dá)）等方法揭示了TMED4特異性通過(guò)IRE1α-XBP1信號(hào)軸調(diào)控Treg細(xì)胞Foxp3表達(dá)和抑制功能的機(jī)制。
圖4. TMED4抑制HRD1/BIP介導(dǎo)的IRE1α降解
由于IRE1α蛋白水平的下調(diào)是TMED4缺失的Treg細(xì)胞功能受損的主要原因，本研究驗(yàn)證了TMED4促進(jìn)IRE1α、HRD1（ERAD復(fù)合物組分）及BIP結(jié)合。TMED4通過(guò)抑制ERAD介導(dǎo)的IRE1α蛋白的K48泛素化降解，進(jìn)而維持IRE1α 蛋白水平（圖4）。
圖5. 圖文摘要（左）及封面圖構(gòu)思（右）：TMED4在Treg中維持ER應(yīng)激反應(yīng)和線粒體活性以避免細(xì)胞ROS過(guò)度積累導(dǎo)致Foxp3表達(dá)和細(xì)胞抑制功能受損（左）；取《西游記》孫悟空師徒過(guò)火焰山之意，孫悟空三借芭蕉扇（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）撲滅火焰山火（損壞的線粒體產(chǎn)生的活性氧）（右）。
綜上，本研究揭示了TMED4在平衡ER應(yīng)激反應(yīng)和ROS中所起的作用（圖5），揭示靶向TMED4調(diào)控的Treg細(xì)胞抑制功能可以作為自身免疫性疾病和抗腫瘤免疫的有效策略。
上海市免疫學(xué)研究所吳學(xué)鋒組直博生蔣真言、王會(huì)子，李斌組博士后王曉霞和重慶師范大學(xué)郝友進(jìn)組研究生朵泓睿為本文的共同第一作者，吳學(xué)鋒研究員、李斌研究員以及郝友進(jìn)教授為共同通訊作者。該工作得到了免疫所蘇冰教授，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科王正廷副主任醫(yī)師，武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉勇教授，上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院侯照遠(yuǎn)研究員和張鵬研究員等大力支持。該研究得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、上海市科委等基金項(xiàng)目資助，以及上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院和上海市免疫學(xué)研究所公共技術(shù)平臺(tái)和行政管理部門(mén)的支持。
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