仁濟醫(yī)院 干細胞研究中心 方煜翔
當今社會，惡性腫瘤已成為嚴重威脅人類生命健康的重大疾病之一。“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”是目前腫瘤診斷和治療的重要發(fā)展方向和最有效手段。現(xiàn)有腫瘤診斷方法主要包括：影像學(xué)檢驗和常規(guī)組織活檢，所謂常規(guī)組織活檢是指從患者體內(nèi)通過切取、鉗取或穿刺等方法取出病灶組織，進行病理學(xué)檢查的技術(shù)。這些常規(guī)檢驗方法存在檢測靈敏度低、特異性差、分辨率低、漏檢率高、受腫瘤異質(zhì)性影響大等缺點。通過這些常規(guī)檢驗方法確診的腫瘤往往已經(jīng)進展到中晚期，無法為癌癥早期診斷及實時療效評估提供有效幫助。
液體活檢技術(shù)應(yīng)用于腫瘤早期診斷的優(yōu)勢
近年來快速發(fā)展的腫瘤液體活檢技術(shù)，為實現(xiàn)腫瘤的早診斷、早發(fā)現(xiàn)提供了可能性。液體活檢是指通過常規(guī)方法抽取靜脈血或收集其他體液（如尿液、唾液）后在體液中檢測從原發(fā)腫瘤細胞脫落進入外周血液循環(huán)的各類生物標志物，主要包括循環(huán)腫瘤細胞、腫瘤細胞外囊泡、循環(huán)腫瘤DNA等。腫瘤液體活檢不僅可以用于某些類型的實體腫瘤早期診斷，而且能夠監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)、評估療效，具有標本易獲得、創(chuàng)傷性小、非侵入性、可反復(fù)采集的優(yōu)勢。
從診斷的靈敏度和獲取病理信息能力的角度來比較，與傳統(tǒng)的組織活檢相比，液體活檢的優(yōu)勢之一在于能夠反映病灶的綜合信息。由于腫瘤細胞存在很強的異質(zhì)性，傳統(tǒng)方法只能獲得取樣位置的基因信息，不能反映腫瘤整體上的綜合信息，而液體活檢通過分析腫瘤“分泌物”攜帶的基因信息可綜合反映腫瘤整體的基因信息特點。優(yōu)勢之二在于可以進行高頻率監(jiān)測。腫瘤細胞的基因本身及其表達處于高頻變化的狀態(tài)，必須高頻監(jiān)測才能做到準確用藥并預(yù)判腫瘤耐藥性的產(chǎn)生。液體活檢通過簡單的體液收集即可實現(xiàn)樣本采集的過程，可以滿足高頻監(jiān)測的需求。優(yōu)勢之三在于液體活檢可以顯著降低診斷成本、降低患者的采樣風險及引起并發(fā)癥的風險。
什么是細胞外囊泡？
在眾多的腫瘤標志物中，腫瘤細胞分泌的細胞外囊泡（EV）及囊泡中包含的各類蛋白質(zhì)（包括囊泡膜表面表達的膜蛋白及內(nèi)含的蛋白質(zhì)）、核酸類物質(zhì)（包括微小RNA，長非編碼RNA及編碼RNA等）日益成為腫瘤早期診斷的臨床研究熱點。腫瘤細胞外囊泡是由腫瘤細胞分泌的具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的囊泡狀小體，主要包括外泌體（直徑30-150nm）和微囊泡（直徑200-1000nm）。細胞外囊泡通過攜帶母細胞的蛋白、DNA、RNA等生物大分子，直接或間接調(diào)控受體細胞的功能和表型，參與細胞病理生理學(xué)過程。腫瘤細胞外囊泡在外周血中含量高，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以覆蓋腫瘤異質(zhì)性。
細胞外囊泡攜帶的生物大分子是潛在的腫瘤標志物
近年來，越來越多的研究表明，細胞外囊泡攜帶的蛋白質(zhì)、RNA等生物大分子可以作為潛在的腫瘤標志物應(yīng)用于腫瘤早期診斷。例如，在胰腺癌的相關(guān)研究中，來自美國MD安德森癌癥研究中心的RaghuKalluri教授于2015年在國際權(quán)威期刊《自然》雜志發(fā)表研究論文。他們通過大量的胰腺癌病人血清樣本分析發(fā)現(xiàn)，在早期胰腺癌病人血清中GPC1陽性的外泌體豐度就顯著高于正常人群，而該蛋白在沒有疾病或者是有慢性胰腺炎的患者血清來源的外泌體中完全不存在。可見基于檢測外泌體膜上GPC1表達量的胰腺癌檢測手段，其特異性和敏感性都非常高，更重要的是它可以將慢性胰腺炎與早期或晚期胰腺癌區(qū)分開來。另外，不同于循環(huán)腫瘤細胞需要大量的新鮮血液，在大約零下八十度已深冷保存30 年的血清樣本中依然可以分離和檢測出外泌體。由于胰腺在體內(nèi)的位置相對隱蔽，目前的影像學(xué)檢測精度在早期很難實現(xiàn)對胰腺癌的診斷。在該教授論文中使用的胰腺癌小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)當常規(guī)的核磁共振防范尚未顯示出任何胰腺疾病跡象之時，在小鼠的血清中就已經(jīng)檢測到GPC1陽性外泌體的存在了，后續(xù)的觀察也確實驗證了胰腺部位的腫瘤產(chǎn)生。這一發(fā)現(xiàn)強烈提示了在血清中檢測是否存在GPC1陽性的外泌體對于胰腺癌這類確診較難且進展速度極快的惡性腫瘤的早期診斷具有十分重大的臨床應(yīng)用價值。
此外，細胞外囊泡攜帶的微小RNA同樣提示著腫瘤發(fā)生發(fā)展的潛在的腫瘤標志物。例如，2019年5月，來自日本國立癌癥研究中心的落谷孝広教授在國際權(quán)威期刊《臨床癌癥研究》雜志發(fā)表研究論文，發(fā)現(xiàn)針對血清中細胞外囊泡攜帶的miR-17-3p及miR- 1185-2-3p這兩個microRNA的表達量進行聯(lián)合評價，相較于現(xiàn)有的檢測血液中前列腺特異抗原表達量的方法，可以更有效地區(qū)分前列腺癌與良性前列腺增生，實現(xiàn)對前列腺癌的早期診斷并避免對患者進行無效的組織穿刺，減少患者的治療痛苦并降低患者的醫(yī)療成本。
液體活檢應(yīng)用于臨床腫瘤早期診斷
如何在成分復(fù)雜多樣的血清或血漿樣本中分離提取尺寸較小的細胞外囊泡，如何提高細胞外囊泡檢測方法的靈敏度，是最終實現(xiàn)細胞外囊泡應(yīng)用于液體活檢進行腫瘤早期診斷的關(guān)鍵技術(shù)難點和重點。2019年3月，在國際權(quán)威期刊《自然—生物醫(yī)學(xué)工程》雜志上發(fā)表了來自中科院國家納米科學(xué)中心的孫佳姝教授課題組最新原創(chuàng)性成果。研究人員創(chuàng)新性地利用微流控熱泳富集及核酸適體識別技術(shù)，無需細胞外囊泡分離提取等操作，在極微量（1微升）的血清或血漿樣本中就可對7種細胞外囊泡膜蛋白實現(xiàn)高靈敏、定量、快速、低成本的檢測。研究人員首先利用熒光標記的核酸適體特異性識別細胞外囊泡表面腫瘤相關(guān)膜蛋白。其次，通過激光照射微流控芯片產(chǎn)生溫度梯度誘導(dǎo)的熱泳，使直徑在30-1000nm的細胞外囊泡快速匯聚至芯片中央，而游離的核酸適體或背景雜蛋白仍保持分散狀態(tài)。當細胞外囊泡匯聚后，通過采集結(jié)合在細胞外囊泡上的熒光核酸適體的信號，獲得細胞外囊泡膜蛋白組學(xué)信息。最后，通過大數(shù)據(jù)分析建立相應(yīng)的生物信息算法，將細胞外囊泡膜蛋白組學(xué)信息用于腫瘤的早期自動化分型檢測。在孫教授的研究中，已能在3小時內(nèi)實現(xiàn)對6種常見癌癥（包括I-IV期淋巴瘤、乳腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌）的早期篩查，并區(qū)分不同的癌癥類型。
細胞外囊泡識別捕獲與分析技術(shù)的進步以及高通量數(shù)據(jù)分析能力的提升，為靶向細胞外囊泡及其內(nèi)含物的液體活檢應(yīng)用于腫瘤早期診斷提供了有力的技術(shù)支撐。大力推廣靶向細胞外囊泡及其內(nèi)含物的各類診斷方案，將有助于推動臨床腫瘤早期診斷的普及與常規(guī)化。
