近期，新華醫(yī)院臨床遺傳中心余永國團(tuán)隊(duì)對(duì)23例攜帶PURA基因變異的神經(jīng)發(fā)育障礙（PURA-NDD）患者進(jìn)行了基因型-表型分析，同時(shí)應(yīng)用全基因組甲基化芯片對(duì)其中17例患者外周血DNA進(jìn)行了檢測和分析。發(fā)現(xiàn)了一些之前未被報(bào)道的新表型，同時(shí)全基因組DNA甲基化分析揭示了PURA-NDD獨(dú)特的甲基化譜，攜帶 PURA 單倍劑量不足變異和錯(cuò)義變異的患者具有相似的 DNA 甲基化特征，通過機(jī)器學(xué)習(xí)建立的分類模型幫助3例攜帶PURA意義不明錯(cuò)義變異重新分類為致病變異，進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PURA錯(cuò)義變異與截短變異的細(xì)胞均顯示Pur-α表達(dá)下調(diào)，表明存在共同的單倍劑量不足機(jī)制。該研究首次建立了PURA-NDD的甲基化譜，其可以幫助識(shí)別和診斷不典型PURA-NDD 患者，體現(xiàn)了其在遺傳疾病診斷中的價(jià)值，同時(shí)為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供給了基礎(chǔ)。
文章發(fā)表于Genet in Medicine雜志，第一作者為新華醫(yī)院臨床遺傳中心肖冰和代偉倩，通許作者為徐娜和余永國。
研究對(duì)象和方法
對(duì)23例攜帶PURA基因雜合P/LP, VUS 或者PURA 基因缺失的病例進(jìn)行基因型-表型分析。對(duì)其中17例患者外周血DNA 樣本應(yīng)用全基因組甲基化芯片（Illumina Infinium methylation EPIC V1.0 BeadChips）進(jìn)行檢測和分析。攜帶PURA P/LP變異或5q31.3缺失的8個(gè)病例樣本以及與年齡、性別和芯片類型匹配的對(duì)照樣本作為發(fā)現(xiàn)隊(duì)列。
研究成果
全基因組差異甲基化位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)兩組間存在1802 差異甲基化位點(diǎn)（DMPs）（Δβ＞10%， adjusted P＜0.05）。進(jìn)一步的篩選將DMPs縮小到480個(gè)位點(diǎn)。使用篩選的探針對(duì)樣本進(jìn)行聚類分析和PCA，結(jié)果均可以將病例組和正常對(duì)照進(jìn)行有效區(qū)分（圖1）。以上結(jié)果提示PURA 單倍劑量不足致病變異可以導(dǎo)致特征性甲基化譜。接下來應(yīng)用建立的甲基化譜去預(yù)測其他攜帶PURA-LoF 變異的患者和正常對(duì)照，結(jié)果顯示新的患者和訓(xùn)練集的病例聚集，而對(duì)照和訓(xùn)練集的正常對(duì)照聚類，提示了該甲基化譜的敏感性。隨后，應(yīng)用該甲基化譜對(duì)3例攜帶意義不明錯(cuò)義變異的患者進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)3例患者均和訓(xùn)練集攜帶單倍劑量不足變異的患者聚類（圖2）。這一結(jié)果提示了3個(gè)錯(cuò)義變異可能通過單倍劑量不足機(jī)制導(dǎo)致疾病發(fā)生。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證該甲基化譜的敏感性和特異性，我們應(yīng)用篩選的探針去建立和訓(xùn)練SVM分類器。結(jié)果顯示，所有攜帶PURA變異個(gè)體MVP 值均很高，三個(gè)意義不明確的PURA錯(cuò)義變異被分類為致病性。相比之下，其他從GEO樣本下載的其他樣本的分?jǐn)?shù)都小于0.5，被分類為“非PURA”（圖2）。然而，由于在GEO數(shù)據(jù)庫中下載的綜合征存在批次效應(yīng)，因此需要使用來自相同微陣列平臺(tái)的更多數(shù)據(jù)來驗(yàn)證PURA-NDD甲基化譜的特異性。
進(jìn)一步，我們推測錯(cuò)義變異和LoF變異具有相似的甲基化改變，部分原因可能是因?yàn)閮煞N類型的變異都是通過減少蛋白表達(dá)來導(dǎo)致疾病發(fā)生。我們接下來通過病人外周血淋巴細(xì)胞永生化細(xì)胞株以及體外構(gòu)建的突變體進(jìn)行Western blot 檢測，發(fā)現(xiàn)所有LoF變異和錯(cuò)義變異的細(xì)胞均顯示Pur-a表達(dá)量降低。因此提示這兩種PURA突變類型可能通過共同的單倍劑量不足機(jī)制導(dǎo)致疾病發(fā)生，并與兩者具有相似的甲基化譜改變相關(guān)。
結(jié)論
PURA-NDD的患者表現(xiàn)出特征性的甲基化譜，該甲基化譜將有助于識(shí)別和診斷PURA-NDD患者，并為進(jìn)一步的功能研究提供了啟示。
