近日，Cell子刊STAR Protocols在線發(fā)表了上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院王慧教授和單細(xì)胞組學(xué)與疾病研究中心何牮副研究員聯(lián)合發(fā)表的題為“Isolation of single cells from human hepatoblastoma tissues for whole-exome sequencing”的論文（圖1）。
圖1
該論文提出和展示了一個(gè)簡(jiǎn)單的方案來分離單細(xì)胞并進(jìn)行單細(xì)胞全外顯子組測(cè)序。該策略結(jié)合了單細(xì)胞處理和單細(xì)胞外顯子組測(cè)序，能夠提高外顯子組的覆蓋率和低豐度變異的檢出率，同時(shí)降低實(shí)驗(yàn)的時(shí)間和人力成本。在此之前，團(tuán)隊(duì)圍繞單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)中存在的一系列瓶頸問題，結(jié)合單細(xì)胞（核）分離獲取及單細(xì)胞核測(cè)序技術(shù)，已申請(qǐng)多項(xiàng)發(fā)明專利，助力單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展。
在本研究中，作者詳細(xì)闡述了利用單細(xì)胞外顯子組測(cè)序技術(shù)研究肝母細(xì)胞瘤腫瘤微環(huán)境的實(shí)驗(yàn)方案。通過將單細(xì)胞處理與全外顯子組測(cè)序相結(jié)合，創(chuàng)新性地開發(fā)了單細(xì)胞全外顯基因組測(cè)序技術(shù)，詳細(xì)描述了包括單細(xì)胞分選、全基因組擴(kuò)增、擴(kuò)增均勻性評(píng)估和全外顯子文庫構(gòu)建乃至測(cè)序分析所涉及的一系列步驟。這一工作將多重置換擴(kuò)增技術(shù)（MDA）與基因組多位點(diǎn)qPCR檢測(cè)結(jié)合，在外顯子組捕獲之前就排除有潛在擴(kuò)增偏倚風(fēng)險(xiǎn)的單個(gè)細(xì)胞樣本，最大可能地保證了擴(kuò)增均一性、大幅提升基因組覆蓋度。該方案相對(duì)于傳統(tǒng)的單細(xì)胞全基因組測(cè)序，可提升腫瘤中的低頻突變檢出率，提高研究的解析度，有助于揭示腫瘤遺傳異質(zhì)性等研究。
圖2
綜上所述，該論文系統(tǒng)性介紹了利用肝母細(xì)胞瘤進(jìn)行單細(xì)胞全外顯子組測(cè)序的詳細(xì)流程（圖2），并通過對(duì)文庫進(jìn)行質(zhì)檢以及測(cè)序分析對(duì)該實(shí)驗(yàn)方案的有效性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，確立了該方案在檢測(cè)人類疾病的低頻突變、揭示疾病遺傳異質(zhì)性等方面的穩(wěn)定性及重要性，為疾病演進(jìn)的研究以及臨床診斷和治療提供有效的參考及指導(dǎo)。同時(shí)該研究方案提供了實(shí)驗(yàn)過程中的注意事項(xiàng)與常見問題解決方案，并提供了詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑耗材，對(duì)于后續(xù)發(fā)展及推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
交大醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院院長(zhǎng)王慧教授為該論文的通訊作者，單細(xì)胞組學(xué)與疾病研究中心基因組學(xué)平臺(tái)主任何牮副研究員和孟梅為該論文的共同第一作者。該工作獲得了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC2000700，2022YFD2101500，2022YFD2101503）、國家自然科學(xué)基金（82030099）、上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)（22DZ2303000）、高水平地方大學(xué)創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)等資助。
據(jù)悉，基因組測(cè)序技術(shù)已成為研究疾病分子機(jī)制和遺傳特性的常規(guī)手段，隨著技術(shù)的進(jìn)步，單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)成為提高研究解析度的首選手段。但目前報(bào)道的單細(xì)胞全基因測(cè)序技術(shù)普遍存在測(cè)序數(shù)據(jù)量大，測(cè)序深度低且覆蓋度低,數(shù)據(jù)解讀難度大，錯(cuò)誤率高等缺點(diǎn)，并且其難以區(qū)分真正的生物變異和技術(shù)偽影，不利于深度挖掘低豐度變異，且其昂貴的價(jià)格限制了其在大規(guī)模高通量單細(xì)胞研究中的應(yīng)用。此外，由于約85%的人類疾病相關(guān)基因都集中于占基因組約2%的外顯子部分，因此，積極地開發(fā)高分辨率、高檢出率、低成本的單細(xì)胞外顯子組測(cè)序技術(shù)將大幅提高研究效能。
