堿基編輯是一項(xiàng)具有巨大潛力的基因治療技術(shù),，它可以用來(lái)修復(fù)或修改個(gè)體的基因，從而治療一些遺傳性疾病和其他疾病,。堿基編輯器可以在不產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂的基礎(chǔ)上高效催化堿基轉(zhuǎn)換,，主要包括ABE和CBE兩種，分別實(shí)現(xiàn)A-to-G和C-to-T的轉(zhuǎn)換,。然而,，研究發(fā)現(xiàn)gRNA在靶向編輯的同時(shí)會(huì)與非靶點(diǎn)DNA序列錯(cuò)配，引入非預(yù)期的基因突變,，即脫靶編輯,，這嚴(yán)重制約了基因編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的檢測(cè)脫靶實(shí)驗(yàn)即耗時(shí)又成本高,。為了解決這個(gè)問(wèn)題,，2023年9月2日，公共衛(wèi)生學(xué)院王慧課題組聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王永明課題組,、復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院余波課題組在Nature Communications上發(fā)表了題《基于深度學(xué)習(xí)的堿基編輯脫靶預(yù)測(cè)》（Prediction of base editor off-targets by deep learning）的文章,，該研究的共同第一作者為公共衛(wèi)生學(xué)院的張成東助理研究員及其團(tuán)隊(duì)成員楊元。該研究利用深度學(xué)習(xí)的方法針對(duì)ABE和CBE分別構(gòu)建了gRNA脫靶的預(yù)測(cè)模型，為它們的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),。這些模型可以在網(wǎng)站上免費(fèi)在線使用,，也可以通過(guò)代碼倉(cāng)庫(kù)在本地部署使用。
首先,，研究者針對(duì)ABE和CBE分別設(shè)計(jì)了超過(guò)9萬(wàn)對(duì)gRNA和脫靶序列,，這些序列覆蓋了1～6bp的錯(cuò)配和1～2bp的插入缺失等脫靶類(lèi)型,。通過(guò)將每個(gè)gRNA及其脫靶序列合成到一個(gè)oligo DNA上建立慢病毒文庫(kù),。將文庫(kù)感染表達(dá)ABE和CBE的細(xì)胞，待脫靶序列編輯后,，使用PCR擴(kuò)增并進(jìn)行高通量測(cè)序,，最終得到每個(gè)gRNA的脫靶編輯效率。脫靶編輯效率被定義為包含特定堿基編輯類(lèi)型的Reads數(shù)量與總Reads數(shù)量的比值,。該研究過(guò)濾總Reads數(shù)量少于100的gRNA-脫靶序列組合,，以獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)集。為消除不同gRNA靶向編輯效率的差異,，使用脫靶與靶向編輯效率的比值代替原始的脫靶編輯效率,，用以表示對(duì)脫靶編輯的耐受情況。脫靶類(lèi)型分析發(fā)現(xiàn)所有的突變類(lèi)型都會(huì)導(dǎo)致編輯效率比值降低,。此外,，脫靶位置分析發(fā)現(xiàn)1～10位的突變比11～20位的突變對(duì)編輯效率比值的影響更小。
圖1.BEdeepoff流程圖a.脫靶編輯效率的標(biāo)準(zhǔn)化,。b.數(shù)據(jù)集拆分得到訓(xùn)練集和測(cè)試集,。c.深度學(xué)習(xí)模型結(jié)構(gòu)示意圖
其次，研究者訓(xùn)練了一種基于融合嵌入的深度學(xué)習(xí)模型,，包含Embedding,，LSTM，Attention等模塊,。模型將gRNA和脫靶序列作為輸入,，多種脫靶序列共享相同的gRNA。為防止訓(xùn)練過(guò)程中g(shù)RNA的信息泄漏,，根據(jù)gRNA序列將gRNA和脫靶序列對(duì)分組,，并使用"GroupKFold"的方式將數(shù)據(jù)集分為訓(xùn)練集和測(cè)試集。內(nèi)部測(cè)試數(shù)據(jù)集的結(jié)果表明模型在1~2 bp的錯(cuò)配和1bp的插入缺失上性能表現(xiàn)較好,。對(duì)于外部?jī)?nèi)源位點(diǎn)測(cè)試數(shù)據(jù),，模型預(yù)測(cè)結(jié)果與真實(shí)值之間的相關(guān)性在0.710-0.859。特征歸因分析發(fā)現(xiàn)突變位置的歸因分?jǐn)?shù)都在0以下,，表明這些位置對(duì)最終的預(yù)測(cè)結(jié)果具有負(fù)貢獻(xiàn),。
該研究通過(guò)結(jié)合高通量測(cè)序與深度學(xué)習(xí)實(shí)現(xiàn)了ABE和CBE的脫靶預(yù)測(cè)，模型結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單高效，填補(bǔ)了堿基編輯脫靶預(yù)測(cè)問(wèn)題的空白,，有助于幫助研究者使用設(shè)計(jì)良好的RNA引導(dǎo)序列,，降低脫靶可能性。同時(shí)該方法也可以推廣至其他堿基編輯器的脫靶預(yù)測(cè),。
復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王永明教授,、復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院余波教授、公共衛(wèi)生學(xué)院/單細(xì)胞組學(xué)與疾病研究中心王慧教授為該論文的通訊作者,。公共衛(wèi)生學(xué)院/單細(xì)胞組學(xué)與疾病研究中心張成東助理研究員,、楊元碩士為該論文共同第一作者。該研究得到科技部,、基金委和上海市科委等多項(xiàng)基金的資助,。
