體細胞突變是腫瘤,、衰老和其他多種疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因,，建立高效準確的突變檢測技術是實現(xiàn)健康風險監(jiān)測及預警的重要途徑。但是,，早期突變由于基因組上發(fā)生頻率極低和細胞散在發(fā)生,，難以被測序錯誤率很高的普通二代測序技術（NGS）檢測到。公共衛(wèi)生學院欒洋研究員課題組自主創(chuàng)新建立的超低頻突變檢測技術有望實現(xiàn)任意物種體細胞上全基因組范圍的突變檢測，最新成果于2023年10月在Nucleic Acids Research上以題為Genome-wide direct quantification of in vivo mutagenesis using high-accuracy paired-end and complementary consensus sequencing的研究論文發(fā)表,。此外,，以基因突變?yōu)闄z測終點的人群早期效應標志也是致癌風險評估的重要工具。課題組應用人群外周血建立了PIG-A基因突變檢測技術,，已在致癌物職業(yè)暴露人群初步驗證,，近期應用于苯和多環(huán)芳烴風險評估，研究成果于同年5月和6月分別發(fā)表在Environmental Pollution 和Food and Chemical Toxicology 期刊,。上述技術為突變研究提供了重要工具,。
基于NGS的低頻突變檢測技術研究進展
NGS的出現(xiàn)為突變檢測技術的革新帶來契機，但是,，目前普遍使用的NGS測序錯誤率很高,，所以多應用于檢測體細胞上發(fā)生的胚系突變、和以克隆增生為特征的腫瘤細胞或單細胞上的突變分析,。而正常體細胞因環(huán)境等因素作用后全基因組上發(fā)生的微量突變負荷增加，則難以通過普通NGS檢測,。
為了降低測序錯誤率,，目前公認有效的策略是基于“分子一致性測序”的ecNGS（Error-corrected NGS）技術，簡言之就是針對同一模板來源的多個拷貝測序后進行錯誤校正,，以提高準確性,。該策略最早由華盛頓大學醫(yī)學院研究者提出，命名為“Duplex Sequencing”,，大大降低了測序錯誤率,。但是因為該技術引入PCR擴增環(huán)節(jié)，目的片段產(chǎn)生的拷貝數(shù)過多,，因此測序效率很低,，迄今為止僅應用于局部的靶向測序及小型基因組；Sanger研究所基于該策略也開發(fā)了系列方法,，經(jīng)多次改進后,，于2021年在Nature雜志上報道的“NanoSeq”技術，準確性不僅達到基因組自發(fā)突變水平,，還大大提高了測序效率,，并應用該技術探索了人體組織上細胞分裂程度與突變的關聯(lián)。該技術代表了本領域當前國際最高水準,。
原創(chuàng)性低頻突變測序技術PECC-Seq
盡管已有上述ecNGS技術的見刊論文,，但仍存在一些數(shù)據(jù)分析和技術上的壁壘使其無法被具體和廣泛應用。公共衛(wèi)生學院欒洋課題組經(jīng)過多年研究,，主導開發(fā)了自主創(chuàng)新的分子一致性測序方法,，命名為“PECC-Seq”。技術原創(chuàng)點包括截短片段，PCR-free文庫制備,，DNA互補雙鏈通過雙端測序產(chǎn)生4條重疊片段,，與參考基因組比對進行錯誤校正。該策略大大提高了NGS測序的準確性和測序效率,，首篇論文于2020年在領域權威期刊Archives of Toxicology上發(fā)表后得到關注,。后續(xù)又經(jīng)深入分析，找到測序錯誤主要來源于文庫制備中超聲引起的單鏈損傷,，經(jīng)末端修復被固定,，并應用HPLC-MS技術對損傷產(chǎn)物的“Artifacts”進行了確認。據(jù)此優(yōu)化實驗條件后,，方法在準確性和測序效率上已經(jīng)與“NanoSeq”技術相當,。與經(jīng)典的轉基因動物體內(nèi)突變檢測技術相比，在誘變劑檢測上具有更高靈敏性,。該技術使得人和實驗動物體細胞上全基因組范圍的超低頻突變檢測成為可能,。
PECC-Seq技術可在任意組織檢測單核苷酸突變頻率，并獲得突變特征,，未來有望與其他毒性試驗整合,，替代經(jīng)典體內(nèi)致突變實驗；除環(huán)境誘變劑外,，還可用于干細胞及其衍生細胞治療產(chǎn)品的安全性評價和質量控制,，以及基因編輯技術中脫靶效應的評價與研究；結合DNA加合物組和暴露組分析,，整合動物研究和人群研究,，未來有望用于復雜環(huán)境因素與人類疾病的關聯(lián)及機理研究；此外,，針對已知致癌物暴露的高危人群,，有望用于健康風險監(jiān)測與疾病預防；最后,，還可用于生命科學領域中衰老與發(fā)育研究領域,，回答待解科學問題。
目前PECC-Seq技術已申請專利,，研究進展在國際學術會議上多次進行報告交流并獲得關注,。相關論文的第一作者尤馨悅博士以該研究取得博士學位，并獲得國家自然科學基金青年項目和中國博士后科學基金項目的資助,。
新的遺傳學損傷效應標志——人群外周血PIG-A突變檢測技術
癌癥發(fā)病率逐年增高,，如何預警和防治外源化學誘變劑對健康的危害是重要的科學問題。因絕大多數(shù)化學致癌物具有遺傳毒性,，因此以檢測遺傳學損傷為主的毒性效應標志應用較為廣泛,，目前常用的技術包括檢測DNA損傷的外周血彗星試驗和檢測染色體損傷的外周血微核試驗,。突變和人類腫瘤的發(fā)生密切相關，但是目前尚缺乏以檢測基因突變頻率為終點的人群監(jiān)測方法,。
細胞表面存在的許多分化抗原通過糖基磷脂酰肌醇聚糖(GPI)錨連接在細胞表面,。磷脂酰肌醇聚糖A（Phosphatidyl inositol glycan class A，PIG-A）基因是GPI錨的編碼基因,，且在與GPI錨合成相關的基因中,，只有PIG-A基因位于x染色體上，因此,，PIG-A基因單次突變即可導致該細胞GPI錨缺陷和表面相應抗原缺失,。通過檢測細胞表型（相應表面抗原是否缺失）來考察發(fā)生基因突變的細胞比例，進而計算PIG-A基因突變頻率,，可以評價受試物的致突變性,。外周血是常用的生物學標志檢測樣本，骨髓造血干細胞如發(fā)生PIG-A基因突變,，將導致成熟血細胞表面相應標志缺失從而被檢測到,。目前，在動物實驗上已驗證該方法有效性,，2022年OECD組織將其列入法規(guī),，用于化學物臨床前致突變作用的評價。
據(jù)悉,，公共衛(wèi)生學院欒洋研究員作為OECD專家工作組成員參與了實驗動物Pig-a突變技術指南制訂，課題組于2016年開始在國際上率先開展了人群研究,。目前已建立檢測方法,，并在致癌物職業(yè)暴露人群、化療藥物治療患者上完成了方法驗證,，結果表明該方法作為早期效應標志可用于致癌風險評估,。目前在開展的應用研究包括苯和多環(huán)芳烴職業(yè)暴露風險研究。國際通行的苯職業(yè)暴露限值為1 ppm,，主要基于造血功能障礙和白血病風險,。利用人群紅細胞PIG-A突變檢測技術進行研究和計算，苯的安全濃度被確定為需低于0.07 ppm,，該數(shù)據(jù)為監(jiān)管機構修訂苯的職業(yè)暴露接觸限值以進行更早期風險預警提供了重要參考,。上述結果于2023年5月以題為 Benchmark dose estimation for benzene-exposed workers in China: Based on quantitative and multi-endpoint genotoxicity assessments的研究論文發(fā)表在權威期刊Environmental Pollution上。此外,，在焦爐工隊列研究中也應用PIG-A突變檢測技術對工人進行了風險監(jiān)測,，上述結果于2023年6月以題為PIG-A gene mutation as a mutagenicity biomarker among coke oven workers”的研究論文在Food and Chemical Toxicology上發(fā)表。綜上,，PIG-A基因突變頻率可以成為靈敏的效應標志用于人群風險評估,。需要注意的是該技術無法獲得基因的突變特征,，因此結合PECC-Seq和相關內(nèi)暴露分析將是更好的研究策略。系列論文第一作者為公共衛(wèi)生學院的曹易懿和奚晶老師,。
開發(fā)新技術絕不僅僅是為了論文發(fā)表,，技術只有被用起來才能獲得生命力。期待未來有更多學科交叉與合作的開展,，將上述技術用于化合物/生物制品和環(huán)境因素的安全性評價和人群健康風險評估,，最終為監(jiān)管提供理論依據(jù)，解析復雜環(huán)境暴露的毒性機理,，以及回答生命科學領域中一些待解科學問題,。
上海交通大學公共衛(wèi)生學院欒洋研究員課題組研究方向為遺傳毒理，主要為新技術開發(fā)和外源化合物毒性機理研究,。探索的新技術包括基于一致性測序的低頻突變檢測方法,，新遺傳學損傷效應標志人外周血PIG-A基因突變試驗，基于微流控和微孔板體系的單線蟲高通量毒性測試方法等,；此外,，通過DNA加合物檢測、體外培養(yǎng)細胞DNA損傷,、染色體畸變和基因突變檢測,、轉基因動物基因突變檢測等體系，結合分子生物學手段,，對環(huán)境污染物及中藥有毒成分進行毒性評價和機制研究,。上述研究得到國家自然科學基金項目支持（81873081，82304267,，21477078,，21077112，20807045）,。部分研究與日本國立衛(wèi)生研究院（NIHS）合作由上海交通大學主導完成,。
