近日,，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院-國家熱帶病研究中心全球健康學(xué)院殷堃課題組在國際期刊Chemical Engineering Journal在線發(fā)表了題為“Spatiotemporal dual-dimensional separation enables ultra-simple one-pot CRISPR-based molecular diagnostics”的研究論文,。該研究構(gòu)建了一種基于時(shí)空雙維度分隔的一步法RPA-CRISPR病原體快速檢測(cè)平臺(tái),，通過設(shè)計(jì)物理屏障裝置，實(shí)現(xiàn)兩分隔體系自發(fā)動(dòng)態(tài)融合,，解決氣溶膠污染及體系不兼容問題,，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便、靈敏,、特異的病原體檢測(cè),，為開發(fā)理想病原體檢測(cè)方法提供技術(shù)支撐。
近年來,，基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的檢測(cè)方法已成為分子診斷技術(shù)開發(fā)重點(diǎn),。與等溫?cái)U(kuò)增方法如RPA聯(lián)用可提升基于CRISPR檢測(cè)的靈敏度，然而,，分步法操作涉及擴(kuò)增產(chǎn)物開蓋轉(zhuǎn)移步驟,，增加氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此,，將RPA與CRISPR反應(yīng)整合到一管式封閉體系中可避免此問題,，但一管式檢測(cè)面臨兩體系不兼容問題，檢測(cè)效率顯著下降,。為應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn),，已有研究建立時(shí)間或空間維度分隔的方法，先物理分隔或通過光降解引物分隔兩體系,，后通過離心或光照操作使RPA與CRISPR反應(yīng)混合,，實(shí)現(xiàn)靈敏的一管式RPA-CRISPR檢測(cè)。然而,，這些方法依賴中間操作實(shí)現(xiàn)分步反應(yīng),，因此，一種簡(jiǎn)便,、自發(fā)進(jìn)行的一管式檢測(cè)平臺(tái)仍然亟待開發(fā),。
為解決體系不兼容問題，本研究首先設(shè)計(jì)了一種“管中管”結(jié)構(gòu),，通過3D打印技術(shù)設(shè)計(jì)并打印底部包含數(shù)個(gè)毛細(xì)通道的內(nèi)管作為物理半屏障裝置,，實(shí)現(xiàn)時(shí)空雙維度分隔并能自發(fā)進(jìn)行的RPA-CRISPR一管式反應(yīng)。內(nèi)管底部作為物理屏障在空間維度分隔兩體系,，同時(shí),，內(nèi)管底部垂直貫穿的數(shù)個(gè)毛細(xì)通道將兩體系連接起來,，隨著下方RPA反應(yīng)進(jìn)行,，濃度逐漸增高的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)由毛細(xì)通道向上擴(kuò)散至上方CRISPR體系中,，與crRNA互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合,，激活Cas12a蛋白對(duì)熒光報(bào)告探針的反式切割活性,，并產(chǎn)生熒光信號(hào)，以此形成時(shí)間維度分隔。這種基于時(shí)空雙維度分隔的一步法CRISPR/Cas檢測(cè)方法無需任何中間操作,，反應(yīng)開始后兩體系可逐漸自發(fā)動(dòng)態(tài)融合，實(shí)現(xiàn)真正簡(jiǎn)便的一步法檢測(cè),。該平臺(tái)被用于沙門氏菌檢測(cè),，表現(xiàn)出良好特異性及靈敏度，為開發(fā)理想病原體檢測(cè)方法提供技術(shù)支撐,。
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院-國家熱帶病研究中心全球健康學(xué)院碩士研究生李慧敏為本文的第一作者,，胡沁沁副研究員和殷堃研究員為本文的共同通訊作者,。本研究得到國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目,、上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目、海南省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目等基金支持,。
