在TGFβ研究領(lǐng)域中，長期存在一個(gè)頗具爭議的問題：Smad2/3是否可以獨(dú)立于Smad4傳遞信號(hào)。經(jīng)典的TGFβ信號(hào)主要通過Smad2/3與輔助因子Smad4結(jié)合所形成的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物進(jìn)行傳導(dǎo)。然而，不少研究表明Smad2/3分子有時(shí)也可以替代或繞過Smad4來激活TGFβ下游的靶基因，但其中的調(diào)控機(jī)制亟待研究。
11月22日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院王瓊研究團(tuán)隊(duì)等在Nature Communications上發(fā)表了題為A stepwise mode of TGFβ-SMAD signaling and DNA methylation regulates na?ve-to-primed pluripotency and differentiation的研究。該研究提出了一種胚胎干細(xì)胞在原始態(tài)-始發(fā)態(tài)-分化過程中的分步調(diào)控模型，揭示了Smad2/3通過依賴與非依賴Smad4的兩種方式調(diào)控干細(xì)胞命運(yùn)的精細(xì)機(jī)制，并首次發(fā)現(xiàn)Dnmt3b是磷酸化的Smad2/3的新型互作因子，共同決定干細(xì)胞的命運(yùn)。此外，研究還闡明了TGFβ-Smad信號(hào)通路與DNA甲基化等表觀遺傳修飾協(xié)同調(diào)控小鼠胚胎植入的發(fā)育機(jī)制，為轉(zhuǎn)錄調(diào)控與表觀遺傳互作的協(xié)同調(diào)控提供了新的研究范式。
在經(jīng)典的TGFβ研究領(lǐng)域中，Smad4作為輔助因子扮演了重要的角色。但是，越來越多的研究表明，Smad4并非對(duì)所有信號(hào)傳導(dǎo)過程都不可或缺。例如，在Smad4缺失的情況下，Smad2/3依然能夠進(jìn)入細(xì)胞核。TGFβ/BMP信號(hào)通路對(duì)于胚胎早期發(fā)育必不可少，但是在小鼠上胚層中條件性敲除Smad4 對(duì)于胚胎早期發(fā)育的影響極為有限。此外，盡管Smad4在多種腫瘤中頻繁發(fā)生突變或失活，TGFβ信號(hào)仍然能夠激活部分靶基因，其背后的調(diào)控機(jī)制迄今未達(dá)成共識(shí)。
該研究通過在小鼠胚胎干細(xì)胞中分別敲除Smad2/3和Smad4，并利用干細(xì)胞的分化潛能，深入探討了Smad因子在彼此獨(dú)立狀態(tài)下的功能。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、全基因組結(jié)合分析及DNA甲基化檢測等多種手段，首次提出在胚胎發(fā)育早期，TGFβ-Smad信號(hào)通路通過 “分步走”調(diào)控模式影響胚胎干細(xì)胞的命運(yùn)決定：1）原始態(tài)（na?ve）到始發(fā)態(tài)（primed）的轉(zhuǎn)變：Smad2/3-Dnmt3b軸決定了干細(xì)胞從低甲基化的原始態(tài)向高甲基化的始發(fā)態(tài)上胚層的轉(zhuǎn)變。在這一過程中，Smad2/3結(jié)合并上調(diào)Dnmt3b的表達(dá)。一方面，Dnmt3b促進(jìn)從頭DNA甲基化模式的建立，并甲基化抑制Sox2等多能性因子的表達(dá)，促使干細(xì)胞逐步退出原始態(tài)。因此，在Smad2/3敲除的細(xì)胞中，Dnmt3b的下調(diào)，而僅存的Smad4無法單獨(dú)啟動(dòng)上胚層基因的轉(zhuǎn)錄。另一方面，Dnmt3b直接與Smad2/3互作，促進(jìn)Smad2/3結(jié)合到上胚層基因順式作用元件的低甲基化區(qū)域，這一過程可能依賴于H3K36me2/3的修飾。2）中內(nèi)胚層分化：上胚層通過原腸運(yùn)動(dòng)進(jìn)一步分化為中內(nèi)胚層譜系。在這一階段，從頭甲基化活動(dòng)減弱，并伴隨著Dnmt3b表達(dá)的下調(diào)。Smad4取代Dnmt3b，接過TGFβ信號(hào)傳遞的“接力棒”，形成經(jīng)典的Smad2/3-Smad4轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。因此，雖然Smad4敲除細(xì)胞能夠啟動(dòng)上胚層的形成，但無法推進(jìn)原腸運(yùn)動(dòng)進(jìn)行分化。Smad4的缺失導(dǎo)致干細(xì)胞停滯于分化前的類上胚層狀態(tài)，從而進(jìn)一步增強(qiáng)Dnmt3b與Smad2/3在核內(nèi)的相互作用。
這項(xiàng)工作首次發(fā)現(xiàn)Dnmt3b是磷酸化的Smad2/3的新型互作因子并受其調(diào)控，與Smad2/3共同決定干細(xì)胞命運(yùn)，闡明了信號(hào)傳導(dǎo)和表觀遺傳的協(xié)同作用機(jī)制，進(jìn)而為理解TGFβ信號(hào)在生理學(xué)和病理學(xué)中的作用提供了新的思路。
干細(xì)胞在原始態(tài)-始發(fā)態(tài)-分化過程中的分步調(diào)控模型：首先，Smad2/3通過誘導(dǎo) Dnmt3b的表達(dá)，主導(dǎo)干細(xì)胞從原始態(tài)到始發(fā)態(tài)的轉(zhuǎn)變。一方面，Dnmt3b 確保從頭DNA 甲基化模式的建立，并通過甲基化及時(shí)下調(diào) Sox2 等多能性因子。另一方面，Dnmt3b 通過互作來促進(jìn)Smad2/3與上胚層基因上的低甲基化中心結(jié)合，從而激活上胚層轉(zhuǎn)化。其次，當(dāng)上胚層向中內(nèi)胚層分化啟動(dòng)時(shí)，Dnmt3b 下調(diào)，Smad2/3-Smad4形成經(jīng)典的TGFb轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，結(jié)合并促進(jìn)中內(nèi)胚層基因的轉(zhuǎn)錄。
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院王瓊研究員，上海市免疫學(xué)研究所杜艷華助理研究員和上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院章永春副教授為該論文的共同通訊作者。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院趙冰楠碩士，博士研究生于秀偉，施金彤碩士，馬雙羽博士和李世召博士為該論文的第一作者。上海市免疫學(xué)研究所葉幼瓊研究員為本研究提供了重要支持。該研究得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃，國家自然科學(xué)基金委和上海市自然科學(xué)基金委的支持。
