4月24日，上海市免疫學(xué)研究所葉菱秀團(tuán)隊(duì)與中科院分子細(xì)胞卓越中心孟飛龍團(tuán)隊(duì)在Cell期刊在線發(fā)表了題為“Mesoscale DNA Feature in Antibody-Coding Sequence Facilitates Somatic Hypermutation”的研究論文。該論文從生化、細(xì)胞和小鼠模型三個水平全面揭示了抗體基因互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）編碼區(qū)偏好突變的分子基礎(chǔ)，特別是抗體基因編碼序列DNA柔性的重要生理作用，為下一代抗體基因人源化動物模型的設(shè)計(jì)奠定了理論基礎(chǔ)。
抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)域由結(jié)合抗原的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）和維持免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的框架區(qū)（FR）組成。在體細(xì)胞高頻突變過程中，胞苷脫氨酶AID偏好作用于WRC（W=A/T, R=A/G）基序，引入突變。其中，回文序列AGCT是AID最青睞的底物。然而，同樣的AGCT卻有不同的命運(yùn)，往往表現(xiàn)出在CDR區(qū)域的高突變頻率和在FR中的低突變頻率。突變?yōu)槭裁淳哂衅眯宰钤缬?982年由著名免疫學(xué)家David Baltimore與Klaus Rajewsky等提出，然而，近40多年來，造成“橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳”這一現(xiàn)象的根本原因一直都沒有令人非常信服的答案。
為了攻克這個長期困擾該領(lǐng)域的難題，研究團(tuán)隊(duì)從經(jīng)典的生化實(shí)驗(yàn)出發(fā)，結(jié)合高通量測序技術(shù)，建立了體外檢測抗體基因突變的新方法。研究發(fā)現(xiàn)生化實(shí)驗(yàn)可以重現(xiàn)體內(nèi)CDR偏好突變特征。為了進(jìn)一步確認(rèn)CDR偏好突變是否具有進(jìn)化保守性，研究人員將生化實(shí)驗(yàn)拓展至來自27個物種的1000余條抗體基因，發(fā)現(xiàn)這種偏好突變在很多物種中都普遍存在，尤其是在使用體細(xì)胞高頻突變策略的四足動物（包括人、猴子、鼠、狗、羊駝和鴨嘴獸等）中高度保守（圖1）。
圖1：CDR偏好突變在多個物種中高度保守
Figure 1: CDR hypermutability is evolutionarily conserved.
隨后，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，聚焦于一段抗體基因CDR3序列，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對CDR3序列進(jìn)行隨機(jī)改造，快速獲得了十幾種不同序列環(huán)境的小鼠模型。通過對該區(qū)域突變熱點(diǎn)AGCT突變頻率的分析，發(fā)現(xiàn)序列改變影響了AGCT的突變頻率，并且序列改變越靠近AGCT，對突變頻率影響越大（圖2）。
圖2：CDR3區(qū)域DNA序列的改變影響突變頻率
Figure 2: Mesoscale sequence determines the WRC mutability.
為了進(jìn)一步探尋DNA序列特征，研究人員利用分子動力學(xué)模擬、單分子生化方法，證明了DNA序列的柔性對AID的靶向過程發(fā)揮重要調(diào)控作用，尤其是WRC上游單鏈DNA序列的組成。結(jié)果顯示，單鏈DNA的柔韌性與嘧啶-嘧啶二核苷酸的含量呈正相關(guān)，而抗體基因的CDR區(qū)域編碼序列在進(jìn)化中恰恰獲得了這種高度柔性的特征（圖3）。
圖3：DNA序列柔韌性對突變頻率的影響
Figure 3: Flexible DNA context promotes hypermutation.
最后，研究人員在小鼠體內(nèi)將一段柔性DNA序列插入低頻突變區(qū)FR3，發(fā)現(xiàn)柔性序列極大地提高了FR3的突變頻率，將FR3區(qū)逆轉(zhuǎn)為類CDR區(qū)（圖4）。
圖4：柔性序列將FR區(qū)逆轉(zhuǎn)為類CDR區(qū)
Figure 4: Flexible DNA sequence makes a FR mutable.
綜上，該研究解答了長期困擾這一領(lǐng)域的難題，發(fā)現(xiàn)抗體基因CDR編碼區(qū)DNA柔性促進(jìn)了偏好性突變的發(fā)生；抗體基因編碼序列具有調(diào)控AID突變靶向的非編碼功能。這一工作為DNA力學(xué)性質(zhì)參與調(diào)控細(xì)胞生命過程中提供了例證，也提示DNA柔性等力學(xué)性質(zhì)可能在其他生命活動如腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。中尺度序列特征的發(fā)現(xiàn)，為設(shè)計(jì)下一代抗體基因人源化動物模型構(gòu)筑了底層理論。
中科院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心孟飛龍研究員和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所葉菱秀研究員為該論文的共同通訊作者,分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心博士生王燕燕為該論文的第一作者。這項(xiàng)工作由王燕燕同學(xué)在上海市免疫學(xué)研究所從事研究助理工作時起始，然后在分子細(xì)胞中心攻讀博士期間完成。該工作得到了上海交通大學(xué)達(dá)林泰教授、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院鄭小琪教授、哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Frederick W. Alt教授、中國農(nóng)大趙要風(fēng)教授、瑞典卡羅林斯卡研究所Qiang Pan-Hammarström教授、中科院杭州醫(yī)學(xué)所宋杰研究員、中科院生物物理所黃韶輝研究員、復(fù)旦大學(xué)曹志偉教授、分子細(xì)胞卓越中心劉珈泉研究員等合作實(shí)驗(yàn)室老師和同學(xué)的大力支持。該研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、上海市科技重大專項(xiàng)、上海市自然科學(xué)基金等資助。同時感謝上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院和上海市免疫學(xué)研究所的公共技術(shù)平臺以及免疫所與瑞金醫(yī)院共建的免疫與疾病研究中心對本研究的大力支持。
葉菱秀研究員及課題組簡介
葉菱秀，研究員，博士生導(dǎo)師。2010年博士畢業(yè)于劍橋大學(xué)，2010～2015年于哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院進(jìn)行博士后研究，2016年加入上海交通大醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所并擔(dān)任抗體多樣化課題組長。獲得國家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年項(xiàng)目、國際合作項(xiàng)目等基金資助。葉菱秀課題組長期致力于B淋巴細(xì)胞抗體多樣化分子機(jī)制研究，特別是廣譜中和抗體與自身抗體產(chǎn)生機(jī)制。課題組在體液免疫反應(yīng)和中和抗體發(fā)現(xiàn)上積累了多種技術(shù)和完善的研究體系。實(shí)驗(yàn)室已培養(yǎng)“博新計(jì)劃”博士后、博士研究生多名。歡迎對本課題組研究感興趣的學(xué)生及博士后的加入，共同探討推進(jìn)B細(xì)胞抗體多樣化研究的進(jìn)展。課題組主頁為http://dripwizz.com/sii/info/1053/1455.htm，歡迎感興趣的申請者來函咨詢[email protected]。
